狂犬病毒先导RNA及其宿主互作蛋白的功能研究

发布时间：2020-10-18 06:51

　　 狂犬病是由狂犬病毒引起的人兽共患传染病,人与所有的温血动物都易感并可传播病毒。该病在全球分布广泛,且一旦发病,死亡率几乎为100%,因此给人类健康带来巨大的威胁。全球每年有5.9万人因狂犬病死亡,其中有绝大部分发生在亚洲和非洲的发展中国家。狂犬病毒属于狂犬病毒属弹状病毒科,病毒基因组编码五种结构蛋白,病毒在转录的过程中不仅产生这五种结构蛋白的mRNA,也会产生一段5’端没有帽子结构,3’端没有poly A尾巴的非编码RNA,名为先导RNA。有研究用末端标记的狂犬病毒基因组与被固定毒感染12小时的BHK-21细胞产物做杂交,检测到狂犬病毒感染后产生的先导RNA,长度主要是56 nt和58 nt,其中56 nt的先导RNA的量约是58 nt长度的两倍。并且检测被固定毒感染24小时的细胞时,结果相同,但先导RNA的量比感染后12小时少。该研究中同样也发现了先导RNA有其他的长度,如43 nt、60 nt。狂犬病毒和水泡性口炎病毒的核蛋白都能通过与先导RNA的互作来影响病毒转录和复制之间的转换,决定了病毒是以转录为主还是以复制为主。在狂犬病毒感染时,狂犬病毒核蛋白与先导RNA的互作比核蛋白与核蛋白mRNA的互作、核蛋白和其他非病毒RNA的互作都更强,证明与非病毒RNA和病毒的mRNA相比,核蛋白会优先结合先导RNA。核蛋白和磷蛋白同时表达时,磷蛋白会使核蛋白结合其他RNA的能力降低,但不影响核蛋白结合先导RNA。但是,先导RNA本身的作用以及先导RNA表达的调控机制并不清楚,本实验旨在研究先导RNA的产生、功能以及与宿主之间的关系。以狂犬病毒街毒株DRV-AH08作为研究对象,来研究狂犬病毒的先导RNA。DRV-AH08感染小鼠后提取总RNA建先导RNA文库,通过Sanger测序我们发现,DRV-AH08的先导RNA形式多样,但最主要的长度是64 nt。随后我们用DRV-AH08感染SK-N-SH细胞,并在感染早期提取总RNA建先导RNA文库,然后做高通量测序,高通量测序的结果显示先导RNA的主要长度仍是64 nt。虽然先导RNA长度不同,但是我们预测了56 nt、58 nt和64 nt的先导RNA的二级结构发现,它们的二级结构相似。为了进一步研究先导RNA的功能,我们利用人类腺病毒表达载体,在细胞中和活体中过表达先导RNA。首先是细胞中,用表达载体过表达不同长度的先导RNA,然后感染不同剂量的狂犬病毒(0.01MOI和0.1MOI)发现56 nt、58 nt和64 nt长度的先导RNA均能抑制狂犬病毒的感染,并且我们用体外转录产生的64nt先导RNA转染细胞验证了先导RNA对狂犬病毒感染的抑制作用。然后我们将过表达先导RNA和过表达对照RNA的人类腺病毒通过脑三维立体定位注射的方式分别注射到同一只小鼠的左右脑海马区,再感染狂犬病毒,最后发现在活体水平过表达先导RNA仍然能抑制狂犬病毒的感染。同时我们也在SK-N-SH细胞中再次验证了,过表达先导RNA时,狂犬病毒的基因组RNA显著性减少。通过RNA免疫共沉淀试验我们发现,先导RNA存在时,能抑制狂犬病毒核蛋白与基因组RNA结合。这表明,先导RNA可以通过抑制核蛋白与基因组结合来抑制狂犬病毒的复制。RNA和蛋白互作试验证实宿主中的热休克同源70 KD蛋白,Hsc70,可以与先导RNA互作,并且这种互作是直接的互作。Hsc70和先导RNA互作3D结构模拟结果显示,Hsc70的核酸结合区域可能是结合了先导RNA 51 nt-59 nt的AU富集区。抑制Hsc70的表达可以促进先导RNA的水平升高。同时Hsc70表达水平降低,会导致狂犬病毒的复制减少。而反过来,狂犬病毒感染后也会影响Hsc70的表达,狂犬病毒感染后2小时,Hsc70的水平显著下降,但是感染后36小时,Hsc70的水平又显著升高。这种不同的变化促使我们进一步研究了Hsc70、先导RNA和病毒基因组RNA之间的关系。我们发现狂犬病毒感染早期会抑制Hsc70的产生,从而导致先导RNA含量增加,进而抑制了病毒的复制,而在感染晚期,Hsc70的表达水平升高,先导RNA含量下降,病毒开始大量复制。这种病毒自我调节复制的现象在很多病毒感染时都出现过。鉴于先导RNA能抑制狂犬病毒的复制,我们又通过体外试验和体内试验证实了,感染狂犬病毒后再过表达先导RNA,仍然能够抑制病毒的复制,这提示我们先导RNA可以被开发成狂犬病毒暴露后预防的辅助药物。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

除了犬和猫外，还有狼，浣熊，臭鼬和蝙蝠等。人的狂犬病有 99%传播而来，狂犬病毒感染家养或野生动物后，通过咬伤、抓伤或者唾。在中国有 95%以上的狂犬病例是由发病的犬传染给人类[1, 2]，而在是区域性的发生，主要是由感染了狂犬的蝙蝠传染给人类[3]。病在全球分布广泛，且一旦发病，死亡率几乎为 100%，因此给人类威胁。全球每年有 4 万到 7 万人因狂犬病死亡[4](图 1-1)。最近有研每年在全球的致死人数有可能是官方发布人数的 100 倍以上，并且有是儿童[5]。新中国成立以来，我国经历了至少三次狂犬病大流行。第纪 50 年代；第二次大流行是从 70 年代末到 90 年代初，1981 年死达 7 千多人；到 90 年代中期死于狂犬病的人数逐渐减少至一百多人广泛的动物免疫工作，死于狂犬病的人数又逐年上升，形成第三次2007 年，全国狂犬病死亡 11198 例，占同期各种传染病病死数的 30定传染病病死数之首[6-8]。

图 1-2 狂犬病毒粒子的结构模式图（Matthias J. Schnell et al. 2010）Fig.1-2 Structure of Rabies virus virion狂犬病毒的基因组结构犬病毒基因组是小的、不分节段的单股负链 RNA，大小约 12kb 左可以编码五个结构蛋白，N 基因的前面还有一段先导序列。每个基因码区、编码区和 5’端非编码区组成[15]。病毒转录时最早产生的转录产物是先导 RNA， BHK-21 细胞感染时即可检出 56 nt，58 nt 以及少量其他长度的先导 RNA 产生，先导也没有 polyA 尾巴，也不会翻译成蛋白[19]。病毒有 5 个开放阅读框，不同毒株之间基因长度不完全一样，L 基 或 6384 nt；M 基因最短，一般为 804 或 805 nt ；另外 N 基因一般为

图 1-3 狂犬病毒基因组的结构模式图Fig.1-3 Structure of Rabies virus genome1.2.4 狂犬病毒各结构蛋白的功能1.2.4.1 核蛋白核蛋白（N）相对分子量约为 50.5KD，由 450 个氨基酸组成。不同的毒株之间，N 蛋白高度保守，同源性在 98%以上。在病毒复制过程中，N 蛋白可以与基因组 RNA结合成核糖核蛋白（RNP），维持转录所需的基因组 RNA 螺旋对称结构并保护基因组免受核酸酶的破坏。N 蛋白包裹在 RNA 外形成 RNP，多聚酶（L）和磷蛋白（P）与 RNP 紧密相连成螺旋状结构，使基因组在体内或体外均能转录和复制[22, 23]。狂犬病毒 N 蛋白的 1- 376 位氨基酸构成了 N 蛋白的一个 NH2核，其中 298- 352 位氨基酸有一个特异性 RNA 识别位点，后面即是 C 末端，C 末端可以与 P 蛋白相互作用
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 南海波;;小麦总RNA的提取[J];渤海大学学报(自然科学版);2006年01期

2 杜何为;黄敏;张祖新;;玉米总RNA的小量快速提取[J];河北农业科学;2009年09期

3 夏兰芹,郭三堆;棉花RNA的快速提取方法[J];棉花学报;2000年04期

4 王文锋,肖月华,侯磊,方卫国,裴炎;棉花总RNA的快速提取方法[J];河南农业大学学报;2002年03期

5 毛新国,董玉琛;非编码RNA和RNA沉默[J];生物技术通报;2004年01期

6 陈吉刚,郑肖娟,龚辉,周继勇;RNA干扰研究进展[J];中国预防兽医学报;2004年02期

7 凌宗帅,刘友清,潘学昌,周长桥,魏联果;RNA干扰技术及其应用[J];动物医学进展;2004年02期

8 陈桂信,吕柳新,赖钟雄,潘东明;?嫩芽总RNA的提取与纯化[J];江西农业大学学报;2004年03期

9 张永凤;程备久;;RNA干涉机制研究进展[J];安徽农学通报;2006年05期

10 贺江舟;;脏器RNA提取方法的改进[J];安徽农业科学;2006年20期

相关博士学位论文 前10条

1 张冉;狂犬病毒先导RNA及其宿主互作蛋白的功能研究[D];华中农业大学;2017年

2 王赵玮;昆虫RNA病毒复制及昆虫抗病毒天然免疫机制研究[D];武汉大学;2014年

3 包纯;一类新非编码RNA的发现以及产生和功能的初探[D];华中师范大学;2015年

4 李语丽;基于MeRIP-seq的水稻RNA m6A甲基化修饰的研究[D];中国科学院北京基因组研究所;2015年

5 熊瑜琳;miR-122靶位基因STAT3调控长链非编码 RNA Lethe促进HCV复制的机制研究[D];第三军医大学;2015年

6 范春节;高通量测序鉴定毛竹小RNA及其功能分析[D];中国林业科学研究院;2012年

7 王加强;小鼠着床前胚胎特异ERV相关长非编码RNA的定向筛选及功能研究[D];东北农业大学;2015年

8 王业伟;非编码RNA SPIU的结构和功能研究和p19INK4D在APL发病中的作用[D];上海交通大学;2013年

9 邹艳芬;子痫前期中非编码RNA对滋养细胞功能的调控及机制探索[D];南京医科大学;2015年

10 朱乔;miR-10b在人肝细胞肝癌发生中的作用及其机制的初步探索[D];第四军医大学;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 陆聪儿;条纹斑竹鲨再生肝脏中差异RNA的研究[D];浙江理工大学;2015年

2 张晓辉;小鼠几种长链非编码RNA基因功能的初步研究[D];昆明理工大学;2015年

3 全弘扬;长链非编码RNA在细胞内质网应激反应中的相关作用及机制研究[D];北京协和医学院;2015年

4 胡亮;DDX19A识别PRRSV基因组RNA并激活NLRP3炎症小体[D];中国农业科学院;2015年

5 张帅兵;应用RNA干扰技术对旋毛虫Nudix水解酶基因功能的研究[D];郑州大学;2015年

6 郑芳芳;肺癌RNA-Seq数据中RNA编辑事件的识别算法和系统分析[D];苏州大学;2015年

7 陈瑞东;长链非编码RNA MEG3在胰腺癌发生发展中作用的实验研究[D];苏州大学;2015年

8 刘骏武;线虫和水稻中环状RNA的预测及分析[D];华中农业大学;2015年

9 李猷;利用RNA干扰技术提高番茄抗TMV侵染能力的研究[D];牡丹江师范学院;2015年

10 吴术盛;SVCV感染EPC细胞microRNA表达谱的初步研究[D];华中农业大学;2015年

本文编号：2845964