与猪瘟病毒NS5B相互作用的宿主蛋白的筛选与鉴定

发布时间：2020-10-18 15:08

　　 猪瘟(Classical swine fever,CSF)是一种重要的猪的传染性疾病,给养猪业造成重大经济损失,该病的病原体为猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)。近些年来已经很少见急性典型病例,主要以温和的非典型性病例为主,然而非典型病例的出现使猪瘟的防控形势更加严峻,持续性感染是猪瘟在我国难以根除的主要原因。目前对CSF的治疗无有效方法,猪瘟还继续威胁着养殖业,因此研究并阐明CSFV的致病机制是非常必要的。NS5B蛋白是RNA依赖的RNA酶,保守序列为GDD,负责RNA复制。NS5B蛋白具有类似于右手的手指,手掌和拇指形状的结构域,展示了聚合酶典型的一般折叠。已经证明了NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白对于基因组复制是必须的。非结构蛋白和非编码区之间的相互作用参与调控RNA复制和翻译。然而NS5B蛋白也很可能通过与宿主蛋白之间的相互作用来影响CSFV的复制和翻译,目前NS5B蛋白与宿主蛋白之间相互作用参与病毒复制的机理并不明确。本研究以CSFV NS5B蛋白为诱饵,并将诱饵蛋白NS5B克隆到p GBKT7载体上,通过对诱饵蛋白自激活和毒性检测后,将转化有pGBKT7-NS5B的Y2H Gold酵母菌株与PAM cDNA文库进行杂交试验,最终从不同营养缺陷型培养基上筛选并得到了90个阳性克隆,对阳性克隆进行PCR筛选鉴定,最终得到了60个阳性克隆,对阳性克隆进行测序。通过将测序结果与NCBI数据库中序列信息进行Blast比对分析后,最终得到并确认12个与CSFV NS5B蛋白相互作用的宿主蛋白。从前期筛选的宿主蛋白中选择可能与CSFV复制和细胞自噬相关的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为进一步深入研究的宿主蛋白,酵母回返试验证实了CSFV NS5B蛋白可以与GAPDH蛋白相互作用。随后我们利用GST-Pulldown和激光共聚焦均验证GADPH蛋白与NS5B蛋白存在相互作用。然而GAPDH参与CSFV复制和细胞自噬的相关机制还有待进一步的深入研究。综上所述,本试验通过酵母双杂交技术筛选出了12个与CSFV NS5B蛋白相互作用的宿主蛋白,并且利用GST-Pulldown和激光共聚焦验证了GADPH蛋白能够与NS5B蛋白相互作用。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【文章目录】：
摘要
abstract
文献综述
    第一章 猪瘟病毒及甘油醛-3-磷酸脱氢酶研究进展
        1.1 猪瘟病毒研究进展
            1.1.1 猪瘟概况
            1.1.2 猪瘟病毒研究进展
            1.1.3 NS5B蛋白研究进展
            1.1.4 猪瘟病毒和宿主细胞相互作用的研究进展
        1.2 GAPDH研究进展
            1.2.1 GAPDH与细胞凋亡
            1.2.2 与GAPDH相互作用的其他蛋白质
            1.2.3 GAPDH和端粒
            1.2.4 GAPDH和RNA
            1.2.5 GAPDH和病毒感染
            1.2.6 GAPDH的磷酸化活性
            1.2.7 GAPDH的调节
            1.2.8 GAPDH与神淀粉样蛋白神经退行性疾病
            1.2.9 GAPDH与糖化作用
试验研究
    第二章 酵母双杂交筛选与NS5B相互作用的宿主蛋白
        2.1 材料
            2.1.1 菌株、细胞和质粒
            2.1.2 主要试剂
            2.1.3 仪器设备
        2.2 方法
            2.2.1 载体构建
            2.2.2 互作蛋白的筛选
        2.3 结果
            2.3.1 载体构建及鉴定结果
            2.3.2 酵母菌落PCR鉴定
            2.3.3 诱饵蛋白对酵母细胞毒性的检测
            2.3.4 诱饵蛋白对酵母细胞自激活性的检测
            2.3.5 阳性克隆筛选结果
            2.3.6 阳性克隆的PCR鉴定
            2.3.7 测序结果
            2.3.8 酵母回返试验对蛋白互作的验证
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 猪瘟病毒NS5B与宿主蛋白相互作用鉴定
        3.1 材料
            3.1.1 细胞、菌株与质粒
            3.1.2 主要试剂
            3.1.3 仪器设备
        3.2 方法
            3.2.1 载体构建
            3.2.2 真核重组质粒的转染与表达结果验证
            3.2.3 原核重组质粒的表达与表达结果检测
            3.2.4 GST-Pulldown验证NS5B与GAPDH的相互作用
            3.2.5 激光共聚焦验证NS5B与GAPDH的相互作用
        3.3 结果
            3.3.1 载体构建及鉴定结果
            3.3.2 真核重组质粒的表达鉴定结果
            3.3.3 原核重组质粒的表达鉴定结果
            3.3.4 GST-Pulldown验证NS5B与GAPDH相互作用
            3.3.5 激光共聚焦验证NS5B与GAPDH的相互作用
        3.4 讨论
        3.5 小结
结论
参考文献
致谢
个人简介

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本文编号：2846461