Bif-1蛋白与狂犬病病毒复制的关系研究

发布时间：2020-10-18 17:36

　　 狂犬病(Rabies),又称“恐水症”,是由狂犬病病毒属(Lyssavirus genus)的病毒感染引起的人兽共患传染病。目前所有病例中,因该病毒属最典型成员——狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染引起的狂犬病病例占比最大。虽然使用疫苗并遵循合理的免疫程序能够有效预防狂犬病,但是目前仍然缺少狂犬病发病后的有效治疗方法,一旦出现临床症状,其死亡率几乎为100%。我国是狂犬病的高发地区,死亡人数居世界第二位。因此,迫切需要加强RABV致病机制研究,以便从病毒或宿主角度寻找有效的救治靶点。细胞自噬是发生在细胞质中细胞清除异源性、内源性异物的重要生理过程。大量研究证明,许多病毒的致病机制与细胞自噬有关。例如,水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)诱导的细胞自噬是一种细胞的先天性免疫应答,可抑制VSV的感染;而A型流感病毒等存在干扰自噬的分子机制,抑制自噬的发生而利于病毒的感染。截至目前,有关RABV感染和细胞自噬的研究较少。RABV标准攻击毒株(CVS-11株)能够引起小鼠严重的神经症状,并最终导致被感染小鼠的死亡。本实验室前期蛋白质组学研究结果表明,RABV(CVS-11株)感染的小鼠脑组织中差异表达蛋白高度靶向细胞自噬通路,且宿主自噬相关因子Bax-interacting factor-1(Bif-1)蛋白的表达存在显著差异。为此,本研究选取Bif-1蛋白为研究对象,采用过表达、基因沉默等分子生物学技术,对Bif-1蛋白表达与RABV(CVS-11株)复制的相互关系以及Bif-1蛋白的表达在RABV诱导的细胞自噬过程中的作用进行了初步探索。第一章:RABV感染对不同宿主细胞Bif-1蛋白表达的影响。以RABV(CVS-11株)分别感染小鼠神经瘤细胞(Mouse neuroblastoma cells,NA)和乳仓鼠肾细胞(Baby hamster kidney cells,BHK),每隔12h收取细胞总RNA及蛋白样品,同时设立未经病毒感染的正常细胞对照组。应用实时定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)等方法检测样品中Bif-1mRNA和蛋白质的表达。结果显示,与对照组相比,NA细胞感染RABV后Bif-1mRNA水平表达量升高,而Bif-1蛋白质水平表达量早期短暂升高后又降低;BHK细胞感染RABV后Bif-1 mRNA水平及蛋白质水平表达量均降低。表明RABV感染对神经细胞和体细胞中Bif-1蛋白表达的影响存在差异。第二章:不同宿主细胞Bif-1基因沉默对RABV复制的影响。设计并筛选靶向沉默Bif-1基因的sh RNA质粒。shRNA质粒经脂质体转染NA或BHK细胞24h后接种RABV,于感染后24h、48h收取细胞培养液上清及细胞总RNA样品,同时设立表达无靶向性shRNA的细胞对照组。应用RT-qPCR、TCID_(50)测定的方法检测细胞中病毒基因组RNA及上清中子代病毒的产量。结果显示,与对照组相比,NA细胞Bif-1基因沉默有利于RABV复制;BHK细胞Bif-1基因沉默抑制RABV复制。表明神经细胞和体细胞中Bif-1蛋白基因沉默对RABV复制的影响是不同的。第三章:不同宿主细胞Bif-1蛋白过表达对RABV复制的影响。构建鼠源Bif-1蛋白7种选择性剪接异构体真核表达质粒。转染、接毒及样品检测方法同第二章。同时设立转染空载体的细胞对照组。结果显示,与对照组相比,NA细胞过表达Bif-1b、c、e亚型蛋白抑制RABV复制;BHK细胞过表达Bif-1a、b、c、e亚型蛋白均有利于RABV复制。表明神经细胞和体细胞中Bif-1蛋白不同亚型过表达对RABV复制的影响是不同的。第四章:NA细胞Bif-1蛋白过表达对RABV诱导的细胞自噬和细胞凋亡的影响。应用电镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞术、WB等方法检测RABV感染正常NA细胞或过表达Bif-1蛋白的NA细胞后自噬体生成,自噬关键蛋白LC3-II、SQSTM1的表达,Bif-1与LC3细胞内定位,细胞凋亡标志蛋白Act-casp-3、Annexin V的表达。结果显示,RABV感染诱导NA细胞发生不完整自噬并伴随细胞凋亡;RABV感染诱导Bif-1蛋白与LC3发生共定位;过表达Bif-1蛋白促进了RABV感染后自噬底物的降解,且抵抗RABV感染诱导的细胞凋亡。综上所述,本研究从宿主蛋白和病毒相互作用的角度分析了Bif-1蛋白表达与RABV复制之间的相互关系,并从细胞自噬以及细胞凋亡的角度对Bif-1蛋白在RABV诱导的神经细胞自噬、凋亡中的作用进行了探索,表明Bif-1c亚型具有抵抗RABV复制的作用,可能成为抗RABV药物研发的潜在靶点。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【文章目录】：
中文摘要
abstract
引言
第一篇 文献综述
    第一章 狂犬病概述
        1.1 狂犬病的历史与现状
        1.2 狂犬病病原学
        1.3 狂犬病病毒致病机制研究
        1.4 狂犬病发病后临床处治
    第二章 Bif-1蛋白概述
        2.1 Bif-1蛋白与内吞蛋白家族
        2.2 Bif-1与细胞凋亡
        2.3 Bif-1与细胞自噬
第二篇 研究内容
    第一章 RABV感染对不同宿主细胞Bif-1蛋白表达的影响
        1.1 材料与方法
        1.2 实验结果
        1.3 讨论
        1.4 小结
    第二章 不同宿主细胞Bif-1基因沉默对RABV复制的影响
        2.1 材料与方法
        2.2 结果
        2.3 讨论
        2.4 小结
    第三章 不同宿主细胞Bif-1蛋白过表达对RABV复制的影响
        3.1 材料与方法
        3.2 结果
        3.3 讨论
        3.4 小结
    第四章 NA细胞Bif-1蛋白过表达对RABV诱导的细胞自噬和细胞凋亡的影响
        4.1 材料与方法
        4.2 结果
        4.3 讨论
        4.4 小结
结论
参考文献
导师简介
作者简介及攻读学位期间发表的学术论文
致谢

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本文编号：2846597