猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型联合共检可视化基因芯片检测技术研究

发布时间：2020-10-19 06:38

　　 随着我国养猪业向集约化和规模化方向发展,规模化猪场疫病多发、多种病原混合感染较普遍存在,给养猪业造成了一定损失。其中猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪繁殖障碍的三种重要疫病病原。这三种病临诊症状相似,需要进行鉴别诊断。本研究旨在进行PRV-PPV-PCV2联合共检可视化基因芯片的构建,并建立其检测方法和进行初步应用评价研究,该研究成功制备PRV-PPV-PCV2联合共检可视化基因芯片和建立其检测方法,该检测方法检测结果不需扫描仪肉眼即可见。主要研究如下：1.探针基因重组质粒菌的构建本试验成功构建了用于制备可视化基因芯片的T/NS1和T/ORF2两个检测探针以及T/PUC18和T/GAPDH两个定位探针基因重组质粒菌。根据Genbank中收录的基因序列,设计PPV、PCV2、PUC18和GAPDH各1对特异性引物。以PPV灭活疫苗、PCV2实验室分离株为材料提取其基因组DNA。以各基因组DNA为模板,经PCR扩增克隆获得PPV NS1、PCV2 ORP2、PUC18和GAPDH基因,其长度大小分别为100 bp、122 bp、217 bp、257 bp将所获得的4个基因分别与pMD19-T载体连接后转化大肠杆菌DH5a,经PCR扩增和核酸序列测定成功地筛选出4个探针基因重组质粒菌。为可视化基因芯片的构建建立了可长期保存的探针基因,是芯片制备的核心技术之一2.可视化基因芯片的构建与检测技术优化本试验对可视化基因芯片的制备及其检测操作程序的优化进行了研究,并确定了芯片检测质量与结果判定标准。制备的芯片可对PRV、PPV、PCV2进行检测,并可对PRV的疫苗株与野毒株感染进行区分。基因芯片的制备以探针基因重组质粒为模板,经PCR扩增、乙醇沉淀法纯化制备探针基因。使用Baio(?)点样缓冲液将其稀释至一定浓度,经变性处理后喷样。喷样完成固定一定时间即成功制备好芯片。靶基因的标记以提取的病毒基因组DNA为模板,经PCR扩增对靶基因进行生物素标记。在PCR的扩增标记体系中,加入5'端标记有生物素的上游引物,随着PCR的扩增对靶基因进行标记。芯片制备与检测技术的优化对探针基因喷样浓度、重复喷样次数、探针基因固定时间、杂交时间及底物显色时间进了优化,确定了芯片检测的操作程序为：探针基因喷样浓度为100ng/ul用点样仪一次喷样,放置80℃固定2h即成功制备好芯片。芯片44℃预杂交1.5 h：将靶基因95℃变性10 min后立即冰浴冷却5 min,各取100u1进行芯片杂交1.5 h.然后用洗液Ⅰ,洗液Ⅱ,洗液Ⅲ依次各洗涤5 min； 37℃封闭40min; 37℃酶联30 min后按上述条件再次洗涤,加入底物显色8 min后即完成杂交。芯片检测质量与结果判定标准确定了芯片检测质量与结果判定的标准：根据阳性对照生成棕色斑点,空白对照无斑点生成,以及阴性对照无斑点生成或斑点颜色较淡来判定芯片的质量；根据靶基因与阴性对照和空白对照的斑点颜色对比的深浅来判定检测结果是否为阳性。3.可视化基因芯片检测技术的评价本试验对决定芯片质量的特异性、灵敏性和保存期进行了研究,并将其应用于临床样本的检测,同时比较其与PCR检测结果的吻合度。特异性、灵敏性和保存期检测对所构建芯片的特异性、灵敏性和保存期进行了研究。分别用PRV、PPV、PCV2、CSFV、PRRSV、JEV PCR标记产物与芯片进行杂交,以检测其特异性；将各探针基因质粒DNA、PCR扩增标记,分别作10×系列倍比稀释后与芯片进行杂交,以检测其灵敏性；以PCV2检测基因芯片为例,分别将保存30天、60天、90天和120天后的芯片各抽取一张,进行杂交检测,以检测其保存期。结果表明,CSFV、PRRSV、JEV检测结果均为阴性,PRV、PPV、PCV2各靶基因之间也无交叉反应,表明其特异性好；PRV-gB、PRV-gE、PPV-NS1和PCV2-ORF2探针基因的灵敏性分别为：18.3 pg/μl、17.4pg/μl、11.7 pg/u和13.2 pg/μl,均较PCR灵敏性高10倍；芯片在保存120天后仍可进行有效检测。临床样本检测应用所构建的芯片对四川、重庆、福建、贵州、甘肃等地103份临床样本进行了检测。提取病死猪的组织基因组DNA,用PCR扩增标记后进行杂交检测,比较其与PCR检测结果的吻合度。结果表明：PRV、PPV、PCV2的阳性率分别为22.3%(其中疫苗株为2.9%,野毒株为19.4%)、8.7%、78.6%,PRV-PPV为8.7%,PRV+PCV2为22.3%,PPV+PCV2为8.7%,PRV+PPV+PCV2为8.7%.表明临床上这三种病的混合感染情况较为普遍。芯片与PCR的检测总符合率均在97%以上,表明所构建的芯片质量可靠,可用于临床样本的检测。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S852.65
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 文献综述
    1 猪伪狂犬病概述及其诊断方法
        1.1 概述
        1.2 猪伪狂犬病诊断方法
            1.2.1 传统诊断方法
            1.2.2 分子生物学诊断方法
            1.2.3 血清学诊断方法
    2 猪细小病毒病概述及其诊断方法
        2.1 概述
        2.2 猪细小病毒病诊断方法
            2.2.1 传统诊断方法
            2.2.2 分子生物学诊断方法
            2.2.3 血清学诊断方法
    3 猪圆环病毒感染概述及其诊断方法
        3.1 概述
        3.2 猪圆环病毒诊断方法
            3.2.1 传统诊断方法
            3.2.2 分子生物学诊断技术研究进展
            3.2.3 血清学诊断方法
    4 可视化基因芯片技术在疾病检测中的应用
        4.1 可视化基因芯片在病毒病检测中的应用
        4.2 可视化基因芯片在细菌病检测中的应用
    5 本研究的目的与意义
第二章 探针基因重组质粒菌的构建
    1 材料
        1.1 种毒
        1.2 探针基因重组质粒菌
        1.3 主要实验仪器
        1.4 主要试剂
    2 实验方法
        2.1 探针基因重组质粒菌的制备
            2.1.1 引物设计
            2.1.2 病毒基因组的抽提
            2.1.3 探针基因的PCR鉴定
            2.1.4 探针基因的胶回收
            2.1.5 探针基因的连接
            2.1.6 探针基因的转化
        2.2 探针基因重组质粒菌鉴定
            2.2.1 探针基因重组质粒菌质粒提取
            2.2.2 探针基因重组质粒菌的PCR鉴定
        2.3 探针基因重组质粒序列测定和同源性分析
        2.4 探针基因重组质粒菌的保存
    3 结果与分析
        3.1 探针及定位基因引物设计结果
        3.2 基因组DNA的PCR鉴定结果
        3.3 探针基因胶回收
        3.4 探针基因转化结果
        3.5 探针基因重组质粒菌PCR鉴定结果
        3.6 探针基因序列分析
            3.6.1 PPV-NS1基因序列分析
            3.6.2 PCV2-ORF2基因序列分析
            3.6.3 PUC18基因序列分析
    4 讨论
        4.1 探针基因的选择
        4.2 引物的设计
        4.3 探针基因的PCR扩增、克隆、鉴定
        4.4 探针基因序列分析
    5 小结
第三章 PRV-PPV-PCV2可视化基因芯片的构建与检测技术优化
    1 材料
        1.1 探针基因重组质粒菌
        1.2 主要实验仪器
        1.3 分子杂交材料与试剂
        1.4 其他主要材料与试剂
    2 实验方法
        2.1 探针基因的制备
            2.1.2 探针基因的PCR扩增
            2.1.3 探针基因的纯化
            2.1.4 探针基因的浓度及纯度测定
        2.2 可视化基因芯片的制备
            2.2.1 阵列的设计排布
            2.2.2 喷样
            2.2.3 探针基因固定、密封与保存
        2.3 靶基因的PCR扩增标记
        2.4 可视化基因芯片检测操作程序
            2.4.1 预杂交
            2.4.2 杂交
            2.4.3 封闭
            2.4.4 酶联
            2.4.5 显色
        2.5 可视化基因芯片的优化
            2.5.1 载体的选择
            2.5.2 探针基因喷样浓度的选择
            2.5.3 重复喷样次数的选择
            2.5.4 探针基因固定时间的选择
            2.5.5 芯片杂交时间的选择
            2.5.6 底物显色时间的选择
    3 结果与分析
        3.1 探针基因PCR扩增结果
        3.2 探针基因浓度及纯度测定结果
        3.3 靶基因PCR扩增标记结果
        3.4 可视化基因芯片的优化结果
            3.4.1 载体选择结果
            3.4.2 探针基因喷样浓度选择结果
            3.4.3 探针基因重复喷样次数选择结果
            3.4.4 探针基因固定时间选择结果
            3.4.5 芯片杂交时间选择结果
            3.4.6 底物显色时间选择结果
    4 讨论
        4.1 基因芯片的制备
        4.2 靶基因的标记
        4.3 芯片背景值的控制
        4.4 视化基因芯片的检测结果判定
    5 小结
第四章 可视化基因芯片的检测技术评价
    1 材料
        1.1 基因芯片
        1.2 探针基因重组质粒菌
        1.3 临床样本
        1.4 主要试剂与仪器设备
    2 实验方法
        2.1 可视化基因芯片特异性检测评价
        2.2 可视化基因芯片灵敏性检测评价
        2.3 可视化基因芯片的保存期检测评价
        2.4 可视化基因芯片临床样本检测评价
    3 结果分析
        3.1 可视化基因芯片特异性检测评价结果
        3.2 可视化基因芯片灵敏性检测评价结果
            3.2.1 基因芯片灵敏性检测结果
            3.2.2 PCR灵敏性检测结果
        3.3 可视化基因芯片保存期检测评价结果
        3.4 可视化基因芯片临床样本检测评价结果
    4 讨论
        4.1 基因芯片检测的特异性、灵敏性与保存期
        4.2 临床样本检测
    5 小结
研究结论与创新
    1 研究结论
    2 研究创新点
参考文献
致谢
附录

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本文编号：2846856