稳定表达CD163的猪肺泡巨噬细胞系建立及其特性研究

发布时间：2020-10-19 09:49

　　 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)在世界范围内普遍流行,它是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS Virus,PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍、断奶仔猪呼吸道症状、生长迟缓以及高死亡率为特征的一种急性、高度传染的病毒性疾病。由PRRSV诱导细胞因子分泌的体外研究需要猪肺泡巨噬细胞(PAM)和与免疫细胞的相互作用。然而,已有的永生化PAM细胞不允许PRRSV感染。从猪原代PAM(pPAM)分离的猪CD163受体可赋予PRRSV对非易感细胞的感染性,从而建立新的细胞系以更方便地研究PRRSV感染动力学及其诱导相关细胞因子分泌的分子机制。本研究以pPAM扩增CD163基因,利用慢病毒表达系统将其插入到永生化PAM细胞的染色体中,使其随细胞增殖而稳定表达。试验鉴定显示,用高致病性(Highly Pathogenic)HP-PRRSV毒株JXA1感染mPAM-CD163细胞,能产生高于10~9 copies/mL滴度的子代病毒;该细胞系能够稳定传代至少100代。此外,我们还研究了接种不同毒力PRRSV的mPAM-CD163和pPAM中的相关细胞因子和Toll-like receptors(TLR)的表达状况。mPAM-CD163细胞系与pPAM细胞相比显示了极其相似的病毒复制和细胞因子分泌规律。因此,本研究建立的稳定的表达CD163的PAM细胞系可替代原代PAM细胞用于体外实验,研究细胞因子分泌机制和PRRSV感染的PAM细胞与免疫细胞之间的相互作用。从4-6周龄的PRRSV、PCV2双阴性仔猪肺中获取pPAM细胞,按照猪CD163的基因序列设计引物,利用PCR方法扩增猪CD163基因。将扩增的CD163基因片段连接到克隆载体pEASY-T1,构建克隆质粒pEASY-T1-CD163。用限制性内切酶Xba I和Xho I分别双酶切pEASY-T1-CD163和pLV-sf GFP(2A)Puro,从载体质粒pEASY-T1-CD163上将CD163基因克隆至慢病毒基因过表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro中。将连接产物转化至E.coli Competent Cell JM109中,阳性重组质粒经测序鉴定命名为pLV-EGFP-CD163。将无内毒素pLV-EGFP-CD163质粒加入到293T细胞中培养,收集培养液得到病毒颗粒。经过嘌呤霉素筛选出适合永生化PAM细胞生长的最佳浓度后,在含有嘌呤霉素的培养基中加入慢病毒颗粒进行感染,得到含有目的基因的细胞群细胞。将细胞群细胞稀释后接种到96孔板培养,采用有限稀释法获得单克隆细胞株。将筛选到的稳定表达CD163的单克隆细胞株命名为mPAM-CD163。该细胞系经过Western blot试验,结果显示mPAM-CD163细胞中CD163蛋白得到了正确的表达,分子量约为130 KDa。抗体阻断试验表明,抗CD163抗体与CD163结合后,与对照组相比PRRSV滴度以剂量依赖性方式减少。共聚焦结果显示,CD163蛋白主要定位在细胞的胞膜。此外,该细胞系允许PRRSV感染并且产生超过10~9copies/mL高滴度的子代病毒,该细胞系能够至少传代100代。用HP-PRRSV JXA1毒株和经典SD1株感染该细胞系,产生的病毒粒子数虽然低于pPAM,但是其变化趋势与pPAM相似。用不同毒力的高致病性PRRSV JXA1毒株与经典PRRSV SD1毒株感染pPAM和mPAM-CD163细胞,荧光定量PCR方法测定相关细胞因子(IL-4、IL-10、IFN-α、IFN-γ)和Toll受体(TLR-3、TLR-7)的表达水平。结果显示,本实验构建的细胞系与pPAM细胞在细胞因子方面有几乎相同的变化规律,其中,在24 hpi IL-4和6、12 hpi IL-10的mRNA和上清水平与原代细胞的分泌不同;在Toll样受体mRNA表达的变化规律是一致的。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：

与辅助亚基一起，这些酶组装成膜相关的病毒复制和转录复合物（Pedersen et al.,999），其介导基因组复制和嵌套的亚基因组 mRNA 的合成。.2.3 PRRSV 编码的结构蛋白ORF2-5 编码糖基化膜蛋白 GP2-GP5，ORF6 编码非糖基化膜蛋白（M），ORF7 编核衣壳蛋白（N）（Snijder and Meulenberg, 1998；Dea et al., 2000）（图 2）。其中 GP2白是由两个囊膜糖基化蛋白 GP2a 和 GP2b 组成的（Wu et al., 2001），所有的结构蛋白对感染性至关重要（Molenkamp et al., 2000；Wissink et al., 2005）。GP5 和 M 是 PRRSV膜的主要组成成分，它们在病毒中一起构成形成二硫键连接的异二聚体（Dea et al.,000；Mardassi et al., 1996）。有研究表明：从 PRRSV 感染性克隆中删除这两个中的任个蛋白都会导致无法产生病毒颗粒，而次要包膜蛋白的缺失对病毒颗粒的产生没有影（Wissink et al., 2005）。

图 3 PRRSV 细胞受体（Zhang and Yoo, 2015）Fig.3 cellular receptors for PRRSV1.4.2 病毒侵入宿主细胞的过程吸附、侵入、脱壳、病毒成分的合成、病毒粒子的装配和释放等步骤是病毒侵染细胞的生命周期。对于无囊膜病毒而言，吞饮是主要途径，在网格蛋白的作用下宿主细胞膜内陷进而使病毒进入被感染的细胞；对于有囊膜的病毒来说，病毒与胞膜融合过程包括了吸附、侵入、脱壳的过程，这是一个连续的过程。决定感染成功与否的关键环节是病毒的吸附过程。需要病毒表面特异性的吸附蛋白与细胞表面受体（病毒受体）相互作用。大部分动物病毒的病毒受体是镶嵌在细胞膜脂质双分子层中的糖蛋白，另外也有糖脂或唾液酸寡糖苷。在 0-37℃内温度越高病毒吸附细胞表面受体效率也就越高，在几分钟到几十分钟时间内整个过程即可完成。病毒的细

ISPR/Cas9 技术，导致生产了编码 SRCR5外显子 7缺失的SRCR5 的缺失对正常饲养条件下的猪在生长率和完整从动物中分离 PAM 和外周血单核细胞（PBMC），并SF1 刺激细胞显示相应来源的巨噬细胞的特征性分化和失 SRCR5 的 CD163 在巨噬细胞表面的表达和正确折叠除剂的蛋白质的生物活性。种红细胞结合因子，通过与结构域 SRCR2 和表达 CD1除衰老和畸形的成红细胞，从而增强未成熟成红血细胞RCR3 作为血红蛋白（Hb）-触珠蛋白（Hp）清道夫受红蛋白具有氧化性和毒性；一旦与 Hp 结合，其通过与并随后被内吞而被清除。这可以防止氧化损伤，保持体（Burkard et al., 2017b）。
【参考文献】

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1 王晓佳,张卫红,汪明,高福;囊膜病毒膜融合的分子机制[J];生物化学与生物物理进展;2004年06期

本文编号：2847051