基于转录组学进行肉牛不同大理石花纹等级分子机制的研究

发布时间：2020-10-20 16:36

　　 肌内脂肪(IMF)沉积是一个复杂的数量性状,单独研究一个基因对IMF含量(大理石花纹)的影响收效甚微,因此本研究选取同一遗传背景和饲养管理,背最长肌IMF含量极端差异的两组复州牛x利木赞x和牛杂交牛(crossbreed of Fuzhou Yellow ctle×Limousine×Wagyu,FLW)牛,利用二代测序技术筛选影响IMF沉积的差异基因、SNV和新转录本,并分析牛的解藕联蛋白3(uncoupling protein3,UCP3)和甲状腺激素应答蛋白(Thyroid Hormone Responsive Spot14protein, THRSP)基因内含子上SNP与FLW牛大理石花纹性状的相关性,旨在为阐明IMF沉积相关分子机理以及进一步筛选IMF沉积有效的分子标记提供理论依据。 通过转录组测序分析,共发现749个在两组中差异表达的基因(FC≥2,P≤0.05),其中在大理石花纹等级高的FLW牛(Y2)中高表达的基因共366个,低表达的基因共383个。对749个差异基因进行GO富集分析,发现在David数据库中注释了696个基因,富集于956个Category,根据Category功能的相关性进行聚类,共聚类145个Cluster,其中8个Clusters与脂肪和脂肪酸的消化、吸收、转运等过程有关,去除重复基因后8个Cluster有48个差异基因。对差异基因进行KEGG富集分析,有两条与脂肪代谢相关的通路被富集,分别为MAPK信号通路和PPAR信号通路。经荧光定量PCR验证,8个基因表达趋势与RNA-Seq结果一致,说明RNA-Seq结果可靠。 进一步对差异基因进行深入分析发现,21个与脂肪代谢相关的差异基因,其中PPARGCiA和PPARGC1B基因,与PPAR信号通路相关的SLC27Al和SLC27At基因在Y2中高表达。其它一系列基因(SCD.ABHD5.PRKAG2.GADD4G(?)HRSP)也在Y2中高表达。9个与脂肪代谢相关的基因(APOM、APOL3、APOAl、APOE(?)FOXC2基因)在Y2中低表达。在果糖和甘露糖代谢通路中,FBPl、HK2和TSTA3基因在Y1中高表达,而PFKFB2和PFKFB3却在Y2中高表达。与成纤维相关的基因12个,TGF-β111、TGF-βIGFBP6FGFR-4在大理石花纹等级低的FLW牛(Y1)中高表达。同时,与降低纤维沉积相关的DKK1基因以及COL11A2和COL22A1,在Y2中高表达。MPPl9.COL14A1、COL16A10、COL1A1.COL1A2以及TGA8、ITGB4、ITGBL1除了ITGB6.)基因,它们的表达量也在Y1中上调。与成肌相关的基因6个,MyoD、Myog、Myf6、MYl3、Myl6B和MYL9基因在Y1中高表达。 利用第一代测序,分析差异基因UCP3和THRSP内含子上SNP位点,并将其与FLW牛大理石花纹等性状进行关联分析,发现UCP3第五内含子5个SNP位点中,C786G和C782G位点CG型个体脂色等级和脂肪含量显著高于CC型个体(P0.05)。A559G位点AG型个体脂色等级和脂肪含量显著高于AA型个体(P0.05)；G457T位点GT型个体相关性状(眼肌肉长、三角牛腩等级、背膘脂肪厚、脂色等级、肉色等级、大理石花纹等级)显著高于GG型个体(P0.05)；同时以上位点纯合型个体鲜肉水分含量显著高于杂合型个体(P0.05)。THRSP内含子存在的6个SNP位点,T448C杂合TC型个体大理石花纹等级显著高于TT型个体(P0.05),其余5个位点与FLW牛大理石花纹等性状均未达到显著差异。 本研究利用高通量测序对牛肌肉转录组进行测序,筛选出一系列与IMF沉积相关的基因、SNP和新基因,为进一步研究IMF沉积提供了基础,同时也为利用现代生物技术培育生产大理石花纹肉的新牛种提供了宝贵数据依据。此外,UCP3和THRSP基因内含子上发现的与大理石花纹等性状有显著关联的SNP位点,为UCP3和THRSP:基因在肉牛育种工作中的应用提供了试验依据。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S823
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
目录
英文缩略词
第一部分 文献综述
    1 前言
    2 IMF的组成与分布
    3 IMF的沉积
        3.1 IMF的合成
        3.2 IMF的分解
        3.3 IMF代谢的调节
    4 IMF沉积的分子基础
    5 IMF与牛肉品质的关系
    6 影响IMF的候选基因研究
    7 转录组测序(RNA-Seq)技术
        7.1 RNA-Seq原理
        7.2 RNA-Seq应用
    8 研究意义
    9 技术路线
第二部分 FLW牛不同大理石花纹等级肌肉转录组分析
    第一章 FLW牛不同大理石花纹等级肌肉转录组测序分析
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 试验动物
            2.2 试验动物屠宰、分割及取样
            2.3 RNA—Seq测序设备
            2.4 主要试剂及溶液
            2.5 总RNA的提取及质检方法
            2.6 测序cDNA文库构建
            2.7 mRNA-Seq文库质检
            2.8 上机mRNA-Seq和原始数据预处理
            2.9 RNA-Seq数据分析流程
            2.10 差异基因荧光定量PCR验证
        3 结果与分析
            3.1 总RNA提取与质量检测
            3.2 转录组原始数据碱基质量信息统计
            3.3 Reads统计及与基因组mapping结果统计
            3.4 牛肌肉表达基因分析
            3.5 差异基因筛选与聚类分析
            3.6 差异基因功能分析
            3.7 牛肌肉转录组SNV分析
            3.8 新基因预测统计
            3.9 差异基因实时荧光定量PCR
        4 讨论与结论
    第二章 比较不同大理石花纹等级牛肉中成脂、成纤维、成肌因子的研究
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 试验动物和样品准备
            2.2 RNA提取和RNA-Seq
            2.3 数据分析和生物信息学分析
        3 结果
            3.1 成脂基因的表达
            3.2 成纤维基因的表达
            3.3 成肌基因的表达
        4 讨论
            4.1 牛背最长肌中成脂分子的表达和脂肪代谢
            4.2 牛背最长肌中成纤维相关分子的调节
            4.3 牛背最长肌中成肌因子的调节
        5 结论
第三部分 FLW牛大理石花纹相关基因基因型与表现型关联分析
    第一章 UCP3基因第五内含子多态性与FLW牛肉质性状关联分析
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 试验动物信息及样本收集
            2.2 屠宰性状与相关肉质性状测定纪录
        3 DNA测序分析UCP3基因型
            3.1 仪器设备
            3.2 溶液配制方法
            3.3 DNA的提取
            3.4 引物设计与合成
            3.5 PCR扩增UCP3基因部分片段
            3.6 测序UCP3基因部分片段
            3.7 主要分子生物学数据库及分析软件
        4 统计与分析
            4.1 基因频率和基因型频率的计算
            4.2 多态信息含量(PIC)
            4.3 有效等位基因数(Ne)
            4.4 群体杂合度(He)
            4.5 Hardy-Weinberg平衡检测
            4.6 统计分析模型
        5 结果
            5.1 IMF含量结果
            5.2 基因组DNA提取结果
            5.3 UCP3基因DNA部分片段扩增结果鉴定
            5.4 UCP3基因SNPs位点的测序结果
            5.5 UCP3基因多态性位点的遗传分析
            5.6 UCP3基因多态性与FLW群体的胴体肉质性状的相关性分析
        6 讨论
    第二章 THRSP基因内含子多态性与FLW牛肉质性状关联分析
        1 引言
        2 材料与方法
            2.1 试验动物信息及样本收集
            2.2 屠宰性状与相关肉质性状测定纪录
        3 DNA测序分析THRSP基因型
            3.1 仪器设备
            3.2 溶液配制方法
            3.3 DNA的提取
            3.4 引物设计与合成
            3.5 PCR扩增THRSP基因部分片段
            3.6 测序THRSP基因部分片段
            3.7 主要分子生物学数据库及分析软件
        4 统计与分析
        5 结果
            5.1 屠宰性状和相关肉质性状、基因组DNA提取结果
            5.2 THRSP基因DNA部分片段扩增结果鉴定
            5.4 THRSP基因SNPs位点的测序结果
            5.5 THRSP基因多态性位点的遗传分析
            5.6 THRSP基因多态性与FLW牛群体的胴体肉质性状的相关性分析
        6 讨论
第四部分 结论
参考文献
致谢
附录
个人简介

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 祝洪生;陈睿;曾怡;苏胜彦;李齐发;张翔;李二林;方威;谢庄;;朗德鹅THRSPα基因PCR-SSCP分析及与产肝性能的相关性[J];江苏农业学报;2009年04期

2 张小白;昝林森;王洪宝;郝瑞杰;杨彦杰;;五个牛品种THRSP基因257C/G突变的遗传多态性研究[J];中国农业科技导报;2009年05期

3 任亮;朱宝芹;韩丹;张轶博;宋惠娟;曾瑞霞;苏玉虹;;猪UCP3基因多态性及其与脂肪沉积、肉质性状的相关分析[J];农业生物技术学报;2006年05期

本文编号：2848907