GlyRS及其下游蛋白NFκB1和METTL3对牛乳腺上皮细胞自噬的调控作用

发布时间：2020-10-20 17:28

　　 奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)是乳蛋白和乳脂肪合成的基本单元,在乳腺泌乳调控过程中,BMECs的增殖、凋亡和自噬均与乳合成相关,但其详细机理仍有待深入研究。实验室前期结果表明,甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)调节BMECs乳合成功能,GlyRS在胞核中以p-GlyRS的形式与其下游蛋白核转录因子κB1(NFκB1)和m~6A甲基转移酶(METTL3)结合,进一步调节下游靶蛋白mTOR进而促进乳合成,研究表明mTOR与调节细胞自噬相关,但以上三种蛋白是否调节细胞自噬尚未见报道。本研究拟揭示GlyRS及其下游蛋白NFκB1和METTL3是否调节BMECs自噬。前期研究结果表明,p-GlyRS可以激活NFκB1生成p-NFκB1,进一步拟揭示p-GlyRS是否使METTL3磷酸化从而激活METTL3的分子机理,本研究将有利于揭示乳蛋白、乳脂肪调控的分子机理,为牛乳合成调控提供实验数据参考。本研究利用组织块法获取纯化的BMECs,免疫荧光染色法结合Western blot鉴定BMECs中CK18(Cytokeratin 18)及β-酪蛋白(β-casein)的表达以鉴定细胞纯度。分别转染si-GlyRS、si-METTL3、si-NFκB1以及转染NFκB1过表达质粒及添加海藻糖(Tre)自噬增强剂及蛋氨酸(Met),Western blot检测自噬标记性蛋白LC3-II表达量;以上各处理组同时转染pCMV-C-EGFP-LC3B质粒,利用免疫荧光检测细胞自噬斑点(LC3-II)变化。利用免疫共沉淀技术(Co-IP)结合Western blot检测p-GlyRS与METTL3是否存在相互作用。原核诱导表达并纯化GST-METTL3,将其作为底物与通过Co-IP收集到的p-GlyRS进行激酶反应。将pCMV-C-Flag-GlyRS重组质粒转染至细胞中,提纯胞核蛋白,利用Flag纯化试剂盒并结合磷酸化试剂盒进行纯化,获得纯化的p-GlyRS蛋白,和原核表达的GST-GlyRS分别与GST-METTL3进行体外激酶反应,鉴定是否有磷酸化的METTL3蛋白生成。Western blot与免疫荧光染色检测表明,干扰GlyRS基因,抑制p-mTOR表达,促进BMECs自噬;添加Tre与Met并干扰GlyRS基因表达,抑制BMECs自噬。干扰NFκB1基因,正向调控BMECs自噬;过表达NFκB1与添加Tre同时处理后,NFκB1过表达能够减轻Tre诱导的自噬。干扰METTL3基因,抑制p-mTOR表达,促进细胞自噬。以上结果表明GlyRS及其下游蛋白NFκB1和METTL3抑制BMECs发生自噬。体外激酶实验结果表明,通过Co-IP收集到的p-GlyRS和提纯胞核蛋白的p-GlyRS均使METTL3磷酸化。检测GST-GlyRS与GST-METTL3反应组显示GST-GlyRS不能激活METTL3。本实验获得以下结论,G1yRS通过介导Met调控mTOR信号通路,抑制BMECs自噬。METTL3通过mTOR信号途径抑制BMECs自噬,NFκB1抑制BMECs自噬。体外激酶活性分析表明,Co-IP得到p-GlyRS与纯化的胞核蛋白p-GlyRS均使METTL3磷酸化。本研究结果为揭示GlyRS及其下游蛋白NFκB1和METTL3调节BMECs自噬提供了实验依据;也为揭示p-GlyRS调节METTL3的分子机制提供了实验数据参考。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S823
【部分图文】：

组织块培养 10d，组织块周围有细胞爬出；B：BMECs 与成纤维细胞混合C：纯化的 BMECs；D：纯化的成纤维细胞。 began to grow from mammary tissue after 10 days; B: Mixed growth of BMECcells; C: Purified epithelial cells; D: Purified fibroblasts.图 3-1 奶牛乳腺上皮细胞的原代培养与纯化. 3-1 Primary culture and purification of bovine mammary epithelial

：蓝色为 DAPI 标记的细胞核，绿色为 Alexa Fluor 488 标记的 CK18；B：蓝色为 DAPI 标胞核，红色为 Alexa Fluor 647 标记的β-casein。 A: DAPI-labeled nuclei (blue), Alexa Fluor 488-labeled CK 18 (green); B: DAPI-labeled nucleAlexa Fluor 647-labeled β-casein (red).图 3-2 奶牛乳腺上皮细胞 CK18 和β-casein 的鉴定Fig. 3-2 Detection of CK18 and β-casein in BMECs

rn blot 检测奶牛乳腺上皮细胞中 CK18 和 of expression of CK18 and CSN2 in BMEC达对 BMECs 自噬的影响P-LC3B 真核表达载体构建鉴定 RNA 纯度结果如 3-4 所示，说明在提在目的位置处有明显的单一条带，表明扩目的基因片段和真核表达载体 pGCMV-IR例进行连接，然后转化至感受态细胞细胞粒，再进行单、双酶切验证，结果所示。序，确定无碱基突变及缺失后，冻存菌种
【参考文献】

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3 袁文博;;反刍动物乳蛋白合成与营养调控[J];山东畜牧兽医;2008年08期

4 刘琴,毛华明,高俊波;影响牛奶乳脂率的原因及提高的营养途径[J];饲料博览;2004年04期

5 李晓晖;牛乳中酪蛋白的结构特性及其应用[J];食品工业;2002年01期

6 乐志培;蛋白激酶研究进展[J];自然杂志;1999年01期

7 孟国良,尚克刚;小鼠胚胎原代细胞制作方法的改进[J];生物技术;1997年02期

8 巩学千，陈受宜;蛋白激酶：一个飞速发展的领域[J];生物工程进展;1996年01期

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本文编号：2848950