基于2b-RAD技术对天祝白牦牛毛长性状的全基因组关联分析

发布时间：2020-10-21 02:38

　　 天祝白牦牛因其被毛纯白而具有较高的利用价值,除生产肉、绒、毛、奶等产品外,也被当作高原地区景观动物,被毛长短是影响其景观价值的重要因素之一。本研究通过2b-RAD测序,利用一般线性模型和混合线性模型进行全基因组关联分析,筛选与白牦牛被毛长短相关的多态位点和候选基因,并采用实时荧光定量PCR技术对候选基因进行了验证,旨在寻找影响白牦牛被毛长短的分子标记,为长毛型白牦牛的选育提供一定的理论依据。现得到如下结果:1.对60头天祝白牦牛个体进行2b-RAD测序,根据完整性80%,最小等位基因频率(MAF)0.01为标准进行过滤,获得78732个多态性标记。2.通过全基因组关联分析,获得了43个显著相关SNP位点和8个候选基因:位于2号染色体上的FER基因,位于6号染色体上的DKK1基因,位于7号染色上的MST1基因,位于12号染色体上的ZFP36L1基因和PDGFD基因,位于24号染色体上的FGF5基因和LEF1基因,以及位于26号染色体上的BMP6基因。3.实时荧光定量PCR分析发现,在正常个体中皮肤组织中,FGF5基因和DKK1基因表达量极显著高于长毛型个体(P0.01),BMP6基因表达量显著低于长毛型个体(P0.05)。LEF1、FER、MST1、ZFP36L1和PDGFD基因表达量差异不显著(P0.05)。
【学位单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S823.85
【部分图文】：

第二章 材料与方法2.1 材料2.1.1 试验样品试验选取的 60 头白牦牛来自甘肃省武威市天祝藏族自治县松山镇黑马圈河，由天祝县牦牛繁育场提供。白牦牛年龄为 2-3 岁，饲养条件相同，健康状况良好，样本采集时间一致。主要采集对象毛长差异明显的牦牛（如图 2-1），表型数据见附录。现场使用抗凝管采集血样，立即送回试验室进行基因组 DNA 的提取。同时在长毛组和正常组中各选取三头牦牛，分别采取体侧皮肤组织，清洗后放入事先备好 RNAlater 的冻存管中，投入液氮罐带回试验室进行皮肤组织 RNA 的提取。

图 2-2 2b-RAD 建库测序流程Fig.2-2 The test process of 2b-RAD2.2.3.2 信息分析流程利用电子酶切从牦牛参考基因组中提取含有酶切识别位点的标签，作为参考序列；利用 SOAP[105]软件（version2.21）将测序数据比对到参考序列上，利用最大似然法（ML）[106]对多态性位点进行分型。基于上述分析所得，进行生物信息学分析，主要为全基因组关联分析。具体分析流程如下（图 2-3）：(1) 数据过滤：为保证后续数据分析结果的准确性，将 Raw Reads 进行过滤；(2) Enzyme Reads 提取：提取含有酶切识别位点的 Reads（Enzyme Reads）用于后续分析；(3) 数据比对：利用 SOAP 软件将 Enzyme Reads 比对到构建好的参考序列上；(4) SNP 分型：根据比对结果，利用最大似然法（ML）进行分型；(5) SNP 注释：使用 SnpEff 软件对得到的 SNP 进行注释，以确定 SNP 在基因元件的位置、对氨基酸的变化影响。

图 2-3 2b-RAD 生物信息学分析流程图Fig.2-3 The main protocol of bioinformatics analysis2.2.4 全基因组关联分析对样本进行测序分析后，确定本研究最终获得的总标签数目、样品测序深度Unique 标签数目及 SNP 标记数目。对获得的遗传信息进行 SNP 注释，进行目标性状的全基因组关联分析，研究显著相关的 SNP 位点，挖掘影响不同白牦牛个体间被毛长短差异形成的功能基因。通过基于两种不同的算法的统计软件 EMMAX 和 PLINK 分别进行 GWAS先用一般线性模型进行分析（GLM），发现显著关联的位点，再采用混合线性模型（MLM）对目标性状进行关联分析。以群体遗传结构为固定效应，个体亲缘关系为随机效应，以校正群体结构和个体亲缘关系的影响。关联分析的模型为：= a + bx + g + e，（式中 Y 代表性状表型值；a 代表性状平均值；b 代表候选基因型和加性效应；x 代表基因型矢量值（0，1，2），g 代表亲缘关系效应，e 代表随
【参考文献】

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本文编号：2849514