A亚群禽白血病病毒（ALV-A）胶体金检测试纸条的研制

发布时间：2020-10-21 18:46

　　 A亚群禽白血病是由A亚群禽白血病病毒(subgroup A of avian leukosis virus,ALV-A)引发的传染性肿瘤性疾病,主要引起感染鸡长期病毒血症、生长缓慢、免疫抑制、生产性能下降、多组织肿瘤甚至死亡等。该病在我国鸡群中感染率非常高,仅次于J亚群禽白血病,每年对我国的养鸡业造成巨大的经济损失。对该病尚无有效的药物和疫苗,采用淘汰阳性鸡、实施种鸡净化是目前控制该病的主要方法。建立特异、灵敏、快速检测ALV-A的方法是这一防控措施的关键核心技术。现有的检测ALV-A方法繁琐、需要特异设备、耗时长,很难满足临床大批量检测需要。本研究基于胶体金免疫结合和层析原理,通过制备ALV-A的多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb),优化反应条件,研制ALV-A胶体金检测试纸条,对该试纸条性能进行比较分析,结合临床样品检测评价其适用性,为临床应用提供科学依据。本研究首先通过原核表达方法制备ALV-A gp85重组蛋白,纯化后免疫接种兔,四次免疫后取血清,制备pAb,ELISA方法检测抗体滴度和IFA法检测抗体特异性。用实验室制备的ALV-A单克隆杂交瘤细胞株A14GZ接种于Balb/c小鼠,制备腹水,获得ALV-A mAb,检测抗体滴度和抗体特异性。优化反应条件,利用一定大小的胶体金颗粒与mAb制备纳米胶体金标记抗体溶液。pAb包被试纸条硝酸纤维素膜(NC膜),按照胶体金检测试纸条制备方法研制ALV-A胶体金检测试纸条。用已知的ALV-A/B/J/K毒株检测胶体金检测试纸条的特异性,用一定量含ALV-A病毒稀释液和gp85蛋白检测试纸条的灵敏度,在4℃、25℃、37℃条件下分别保存试纸条6个月,用已知ALV-A病毒溶液检测试纸条的稳定性。收集ALV-A病毒感染种鸡的血液、泄殖腔棉拭子、蛋清样品,用研制的胶体金试纸条与IDEXX公司的ALV p27抗原ELISA检测试剂盒进行比较检测,评价试纸条的适用性,分析结果。结果显示:(1)制备的ALV-A gp85蛋白的大小为46 KDa,获得的pAb和mAb的抗体滴度分别为1:10~6和1:2~(13),IFA和Western-blot结果显示两种抗体均特异性的结合ALV-A和gp85包膜蛋白。(2)采用氯金酸和柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液的胶体金颗粒大小为20 nm;用mAb和pAb分别作为标记抗体和检测抗体,胶体金-抗体复合物反应体系的最佳pH值为8.3,抗体的最佳工作浓度为16.8μg/mL。(3)该试纸条能特异性识别ALV-A,但不能识别ALV-B/J/K;对ALV-A的检测下限为64 TCID_(50)/mL,对ALV-A gp85蛋白的检测下限为80 ng/mL;在4℃保存180 d、25℃保存60 d以及37℃保存15 d都具有较好的反应性。(4)该胶体金检测试纸条与国际商业化ALV抗原ELISA检测试剂盒比较结果显示,二者泄殖腔棉拭子样本阳性和阴性重合率为94.06%(190/202),血液样本为95.2%(119/125),蛋清样本为95.31%(61/64);而PCR结果显示,试纸条的假阳性率远低于ELISA。同时,所研制的试纸条具有检测快速、成本低廉、不需特殊设备等优点。以上结果表明:成功研制ALV-A的纳米胶体金检测试纸条,具有特异、灵敏、快速检测ALV-A的特性,可适用于ALV-A的临床批量样本检测。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.65;S852.4
【部分图文】：

g 基因编码的(Hunter et al., 1983)。p27 蛋白是 ALV 的抗原特异性蛋白，其结构中有的易于 ALV 检测的抗原位点，目前临床上很多试剂盒主要通过检测 p27 蛋白来确LV。pol 基因编码逆转录酶和整合酶，此中逆转录酶的目的是将病毒从 RNA 反转录NA 的目的，整合酶的目的是将病毒整合到宿主细胞染色体内。gap 和 pol 这两种基列高度保守且同源性高。gp37 和 gp85 两种糖蛋白是病毒的包膜蛋白由 env 基因编爱建, 1999)，这两种蛋白黏附在病毒包膜上是通过二硫键和其他非共价键作用(柴等, 2009)。gp37 是一种镶嵌蛋白，其任务是把病毒转移到靶细胞里。gp85 则是一膜蛋白，承担辨别宿主细胞膜上的特异性病毒受体含受体决定簇，决定 ALV 的特及中和活性(王增福等, 2005; Dorner et al., 1985)。鉴于 gp85 基因在 ALV 各个亚群存在很大的差异性，利用这个特点可以对 ALV 的亚型确定分析。针对 gp85 基因的性，已经有采用表达 gp85 蛋白用来制作 mAb 和亚单位疫苗(Bova, 1986; Bova-H91)，为疾病防治提供了理论基础。

A 亚群禽白血病病毒（ALV-A）胶体金检测试纸条的研制生素、多肽素等并且不影响其生物学特性。胶体金可以标记抗体或抗原，测方法也有所不同有间接法、竞争法、双抗夹心法等。当然双抗夹心法是目的的检测方法，通过两种抗体对抗原上的不同位点进行结合，该方法具有高敏度，对于一些大分子物质例如病毒、蛋白等通常是采用双抗夹心法检测。的检测试纸条的基本原理：将吸取的样品到样品垫上，抗原从样品垫移动到程，在移动中，抗原会联合在金标垫上的胶体金-抗体复合物并连续挪动到 N和 C 线；在 T 线处，抗原结合的胶体金-抗体复合物会与 T 线上的检测抗体集在 T 线达到显色，而多余的胶体金-抗体复合物会再次向 C 线移动；在 C -抗体复合物与 C 线上质检抗体的联合，汇集的胶体金颗粒也在 C 线中呈现红，当 T 线和 C 线同时呈现红色时，则结果为阳性；只有 C 先呈现红色判定，当 T 线和 C 线无颜色变化，或只有 T 线显示红色时，则结果无效（见图

图 3 胶体金检测试纸条的结构组成Fig.3 The structural composition of the colloidal gold test strip胶体金检测试纸条在人类医学中的应用体金免疫层析法由于它的许多优点被应用于各个方面。在人类医学方面，这项以来被广泛使用。现在，这项技术应用最为常见最为成熟的应用于早孕胶体金条，用于妇女是否怀孕进行初步的检测，采取双抗夹心法检测怀孕的妇女尿液
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本文编号：2850469