Luminex液相芯片同时检测小鼠3种病毒方法的建立

发布时间：2020-10-22 20:08

　　 仙台病毒(Sendai virus, SeV)属副黏病毒科,副黏病毒属,为单股负链RNA病毒。SeV唯一的自然宿主是啮齿类动物,SeV为清洁级和SPF(Specific pathogen free, SPF)级实验小鼠的必须检测项目。小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus, MHV)是冠状病毒科,冠状病毒属的正链RNA病毒,基因组不分节段。MHV是清洁级小鼠必检项目。呼肠孤病毒3型(Reovirus type 3, Reo-3)属于呼肠孤病毒科,正呼肠孤病毒属,是双股RNA病毒。Reo-3为SPF级实验小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠的必检项目。实验动物一旦上述感染病毒,将干扰实验结果,影响科学研究的准确性。目前,实验室诊断主要运用酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学方法,也可通过病毒分离方法检测。ELISA测抗体是检测病毒最常用的方法,但抗体在感染1-2周后才能出现,因此ELISA不适合感染早期的诊断。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)和RT-PCR是重要的分子生物学检测方法,具有简便快速的特点,已广泛应用于病毒学、细菌学、寄生虫学检测中。Luminex液相芯片技术是20世纪90年代兴起的新型检测技术,它集合了激光技术、流式细胞技术以及微球数字信号处理技术。与传统的临床检测方法相比,其主要优点在于高通量、高敏感、重复性高、检测范围广、反应速度快,仅需微量样品即可进行检测等。Luminex具有两大核心技术：xMAP(?)技术和xTAG(?)技术。xMAP(?)技术检测原理为抗原-抗体反应,可用于蛋白质和核酸的检测；xTAG(?)技术能够测定若干基因组形式,如基因表达分析,微RNA分析,单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析,特定序列的检测等。目的：为建立一种能快速检测小鼠SeV、MHV、Reo-3等3种病毒的方法。方法：联合使用RT-PCR技术和Luminex液相基因芯片技术,针对SeV、MHV、Reo-3的保守区域分别设计引物,通过聚合酶链式反应扩增获得大小为263bp、152bp和180bp的目的片段；对引物进行修饰,上游引物分别连接一段特定的TAG序列(与微球上的anti-TAG反向互补),下游引物用生物素标记。利用修饰过的引物重新进行RT-PCR反应,产物与微球进行杂交,建立小鼠3种病毒的液相基因芯片方法；并评价该方法的特异性、灵敏度。分别利用Luminex液相基因芯片和ELISA对送检小鼠进行检测,对比两种方法的检出率。结果：建立的液相基因芯片检测方法能快速检测小鼠SeV、MHV、Reo-3等3种病毒,且该方法方便快速、特异性好、灵敏度高,病毒检出率优于ELISA。结论：成功建立了小鼠3种病毒的液相芯片检测方法。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

得出如下结论；在敏感性方面，通过１０倍连续稀释ＨｅＶ的模板ＲＮ种方法的检测敏感性相当；在准确性方面，Ｌｕｍｉｎｅｘ液相忘片更占优势，液相的区分阴性结果和阳性结果的标准，误判率低，如３号马在感染后２、４和５ｄ液相芯片的方法检测出ＨｅＶ阳性，而巧光定量ＰＣＲ的判定结果为阴性或不确定ｎｅｘ液相芯片技术的应用??ｉｎｅｘ具有两大核屯、技术；ｘＭＡＰ？技术和ｘＴＡＧ？技术。ｘＭＡＰ？技术利用特定的染些微球上偶联有针对不同待测物的抗体或者探针，ｘＭＡＰ？技术可用于蛋白质和。ｘＴＡＧ？技术则使用Ｌｕｍｉｎｅｘ专有的ＴＡＧ标签序列，通过ＴＡＧ序列与微球上序列的互补配对杂交，从而实现样本序列同微球的杂交而不需要单独设计探针。??术能保证相同的复性温度和杂交效率，且有效避免不同检测物标记的微球之间因此，ｘＴＡＧ？技术具有ｘＭＡＰ？技术的优势，但应用相对局限，主要应用在多重检测方面。??巧?核酸鉴定？

Ｆｉｇ３?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?ｘＴＡＧ??４．小结与展望??在实验动物血清学检测方面，尤其是小鼠、地鼠等体型较小的实验动物，可采集分离??出的血清数量少，不能满足常规检测方法对多种病原微生物的检测所需血清的量。而??Ｌｕｍｉｎｅｘ液相芯片仅需要少量的样本即可同时对多种病原微生物进行快速、准确的检测。??Ｌｕｍｉｎｅｘ液相芯片技术具有高通量、高精确性的特点，可应用于多个指标联合检测，在临??床上已广泛应用于肿瘤标志物的检测、自身免疫性疾病早期诊断及遗传性疾病的基因诊断??等方面。当然其技术尚有一些问题需要进一步解决，比如：Ｌｕｍｉｎｅｘ液相芯片不能连续对??待测样品的浓度进行监测；不能监测样品祀序列与微球上探针的结合情况；此外Ｌｕｍｉｎｅｘ??系统是一个开放平台，ＰＣＲ产物和所用化学试剂存在污染实验室的可能Ｗ７＾。??Ｌｕｍｉｎｅｘ液相芯片在蛋白质检测方面，ＣＲＬ进行了深入研究，研制出多通路免疫巧光??检测方法ＭＦＩＡ的相关产品，用于大小鼠、豚鼠、兔等实验动物质量控制，对感染早期敏??

对引物进行在线Ｂｌａｓｔ，查看特异性（引物的Ｓｔａｎｄａｒｄ?Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ?ＢＬＡＳＴ详见附录１）??通过使用单一病毒ｃＤＮＡ与ＳｅＶ、ＭＨＶ、Ｒｅｏ－３等Ｈ种病毒的引物分别进行聚合酶链式反??应。结果发现，在ＰＣ民检测中，未检测出非特异性产物。结果如图５显示；１－３孔是Ｗ?ＳｅＶ??为模板的ＲＴ－ＰＣ民结果；４－６孔是Ｗ?ＭＨＶ为模板的ＲＴ－ＰＣ艮结果；７－９孔为Ｗ?Ｒｅｏ－３为模??板的民Ｔ－ＰＣ民结果。??４００?邮—ＷｔｅｆｇＢＢｉｎ—盈裝化??３００ｂｐ?．．ｉ：由！．?Ｉｉ葡：專；甫避離；繼－电??图５：引物特异化结果??Ｆｉｇ５?ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ?ｏｆ?Ｐｒｉｍｅｒ??３．４测序结果??取Ｈ种病毒的ＰＣ民产物非Ｌ，用浓度为３％的琼脂糖凝胶电泳，选择有条带的、片段??
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本文编号：2852042