空肠弯曲杆菌假定转录调节子Cj0440c对鞭毛合成调控机制的初步研究

发布时间：2020-10-22 20:40

　　 空肠弯曲杆菌(Camplylobacter jejuni)是全球范围内引起人和动物食源性腹泻的主要病原菌,有研究发现,C.jejuni的发病机制与鞭毛在宿主上皮细胞的定植力、黏附、侵袭力以及毒素的产生密切相关。本实验室前期研究发现在红霉素诱导的耐药空肠弯曲杆菌中cj0440c出现上调表达;在C.jejuni NCTC11168中,cj0440c基因缺失突变后,该菌的鞭毛出现断裂,且鞭毛相关基因出现差异表达。cj0440c基因对鞭毛的具体调控机制尚不清楚,NCBI上注释该基因为假定转录调节子,但尚未有研究发现其能调节哪些基因的表达。有研究表明,Cj0440c的同源蛋白TenA(两者同源性为30.7%)为一个硫胺素酶,能参与到硫胺素的合成代谢,猜测Cj0440c也可能具有硫胺素酶的作用。为了研究cj0440c基因的功能,本研究通过观察在不同药物处理下菌株中cj0440c与鞭毛相关基因的表达量,分析cj0440c与各鞭毛基因之间的关系;在大肠杆菌里重组表达Cj0440c蛋白,通过酶解实验验证Cj0440c蛋白是否参与硫胺素的代谢途径;构建空肠弯曲杆菌过表达载体,尝试利用染色质免疫共沉淀的方法体内筛选Cj0440c直接调控的目的基因;通过凝胶阻滞实验体外验证Cj0440c蛋白与前期基因芯片结果中cj0440c缺失突变后差异表达的九个鞭毛相关基因之间的相互作用。测定弯曲杆菌对九种药物(红霉素、阿奇霉素、泰乐菌素、庆大霉素、依替米星、四环素、替加环素、恩诺沙星、加替沙星)的MIC以及MPC,确定各种药物的选择突变窗(MSW),筛选出1/2MPC药物浓度的耐药菌,分析cj0440c以及鞭毛相关基因的表达量。结果显示,在NCTC11168的耐药菌株中,除了替加环素耐药菌中cj0440c下调表达外,其他药物的耐药菌中cj0440c均上调表达。在红霉素诱导的耐药菌中cj0440c上调表达,cj1338c也上调表达,与前期研究中,红霉素耐药菌株cj0440c缺失突变后,cj1338c下调表达结果相符。在所选的两种氨基糖苷类药物以及两种四环素类药物的耐药菌中,其他四个基因的表达趋势与cj0440c一致。而在所选的两种氟喹诺酮类药物中,cj0440c上调表达,cj1338c和cj1339c均下调表达,cj0043和cj0697均上调表达。在ATCC33559的耐药菌株中,除了在红霉素、阿奇霉素、庆大霉素这三种药物的耐药菌中cj0440c上调表达,在其他药物的耐药菌中均下调表达。在红霉素和庆大霉素的耐药菌中cj0440c以及其他的鞭毛基因均上调表达。当cj0440c出现下调表达时,这四个鞭毛基因中至少会有一个基因出现下调表达。反向证明cj0440c能够引起鞭毛相关基因的差异表达。利用pET28a构建含有cj0440c基因的原核表达重组载体P-440,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,采用抗His标签的抗体通过Western-blot来验证表达的融合蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析得到纯化的Cj0440c。以硫胺素为底物,通过观察Cj0440c能否催化硫胺素的降解产生4-甲基-5-羟乙基噻唑和4-氨基-5-羟基甲基-2-甲基嘧啶来验证该蛋白是否具有硫胺素酶的功能。结果表明,反应后的体系中并未发现硫胺素的分解产物。利用大肠杆菌DH5α-空肠弯曲杆菌穿梭载体pRY112构建含有cj0440c的表达载体,用于在C.jejuni中进行染色质免疫共沉淀从体内筛选Cj0440c的调控基因。过表达载体构建成功后,尝试自然转化、电转化以及接合转移的方式将载体转入到空肠弯曲杆菌中,但均未成功,最终改为体外的方式验证Cj0440c对目的基因的调控作用。根据实验室前期研究,挑选出cj0440c缺失突变菌株中九个差异表达的基因(cj1026c(假定脂蛋白)、cj1729c(鞭毛钩蛋白FlgE)、cj1466(鞭毛钩相关蛋白FlgK)、cj0687c(鞭毛基体L环FlgH)、cj0697(鞭毛基体棒蛋白FlgG2)、cj0698(鞭毛基体棒蛋白FlgG)、cj1632c(假定的周质蛋白)、cj1339c(鞭毛蛋白FlgA)以及cj1462(鞭毛基体P环FlgI))进行凝胶阻滞实验。结果发现Cj0440c蛋白不能直接与上述九个基因的启动子片段相结合。综上所述,在九种药物诱导的耐药菌株中,cj0440c与各鞭毛相关基因都出现差异表达,且表达量与红霉素耐药菌株中的表达量以及cj0440c缺失突变菌株中差异表达量相符。当cj0440c下调表达时,所选的四个鞭毛相关基因中至少会有一个基因下调表达,间接验证了cj0440c能够参与到鞭毛的合成代谢。本研究成功表达Cj0440c蛋白,硫胺素酶解实验验证该基因并不具有硫胺素酶的作用。凝胶阻滞实验中,Cj0440c蛋白并不能直接与cj1026c、cj1729c、cj1466、cj0687c、cj0697、cj0698、cj1632c、cj1339c以及cj1462这九个基因的启动子区域相结合,推断出可能Cj0440c并不能直接调控这些鞭毛基因的表达。本课题的研究有助于了解cj0440c与空肠弯曲杆菌鞭毛相关基因间的相互作用,对完善空肠弯曲杆菌鞭毛合成调控机制具有参考意义。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

空肠弯曲杆菌假定转录调节子 Cj0440c 对鞭毛合成调控机制的初步研究2.5 cj0440c 原核表达载体的构建2.5.1 载体构建方案以空肠弯曲杆菌 NCTC11168 的基因组为模板，PCR 扩增出两端含有酶切位点(BamH I 和 Xho I)的 cj0440c 片段，纯化回收后通过 TA 克隆连接到克隆载体 pMD19-T simple 上，构建克隆载体 T-440。T-440 经 BamH I 和 Xho I 双酶切后得到具有黏性末端的 cj0440c 片段，用同样的限制性内切酶来双酶切表达载体 pET28a，利用 T4 连接酶将具有相同黏性末端的cj0440c片段和 pET28a连接到一起构建重组表达载体P-440。载体构建方案如图 1 所示。

图 2 载体 pRY112Fig. 2 Plasmid pRY112加 His 标签的 cj0440c 以及启动子 cmeABC 连接到表达载体 pRY112c 在空肠弯曲杆菌中过表达，并利用 His 标签的抗体来做后续的 ChiBC 启动子以及带有 His 标签 cj0440c1 的 PCR 引物如表 18 所示。表 18 cmeABC、Cj0440c1 PCR 扩增引物序列Table 18 The primers for cmeABC and Cj0440c1 PCR amplification序列 GGACTAGTTAAATGGAATCAATAGCTCCAAAGC CGAGCTCCAGGGTAAGTAAAACTAAGTGGTAA CGAGCTCATGcaccaccaccaccaccacATGCTTTTCTCTAATTTAATCA TCCCCGCGGTTAAAGATTTAATTCCATTCTTAAAGAA

空肠弯曲杆菌假定转录调节子 Cj0440c 对鞭毛合成调控机制的初步研究结果与分析 弯曲杆菌的生长曲线、MIC、MPC 以及 MSW 测定结果在 42℃，5%CO2，10%O2的条件下将空肠弯曲杆菌 NCTC11168 和结肠弯曲杆ATCC33359 在 MH 肉汤中培养至第三代时，取培养不同时间点的菌液，测定其00值，以培养时间为横坐标，测定的 OD600值为纵坐标，绘制生长曲线。如图 3 所示，空肠弯曲杆菌较其他菌株生长较为缓慢，NCTC11168 约 16h 时进长对数期，在 24 h 时 OD600可以达到 0.6，30 h 后才进入生长稳定期。对于C33559 比 NCTC11168 相对较快一点，12 h 时进入生长对数期，在 20 h 时 OD60达到 0.6，26 h 后进入生长稳定期。
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 任方哲;王楠;商宇伟;焦新安;黄金林;;空肠弯曲菌鞭毛研究进展[J];中国人兽共患病学报;2013年08期

2 曾县平;;细菌鞭毛系统的研究进展[J];安徽农业科学;2012年27期

3 惠星星;李烨;王小元;;空肠弯曲菌flhA突变株的构建及其功能研究[J];食品与生物技术学报;2011年03期

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1 郝海红;弯曲杆菌对大环内酯类的耐药发生与适应性研究[D];华中农业大学;2010年

本文编号：2852066