猪瘟病毒疫苗株结构蛋白抗体消长规律研究

发布时间：2020-10-24 02:48

　　 猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病。猪瘟分布广泛,死亡率高,是一种严重危害养猪业发展的重要传染性疫病。目前,我国猪瘟防控工作主要还是采取猪瘟兔化弱毒疫苗预防接种的方式进行,定期对免疫后畜群进行血清抗体检测可以评估疫苗免疫效果,改进和优化疫苗免疫程序,有效地预防和控制猪瘟。本研究在E.coli中表达了CSFV的结构蛋白E0和C,以纯化和鉴定后具有免疫反应性的蛋白作为包被用抗原,分别建立了CSFV血清抗体间接ELISA检测方法,为CSFV抗体监测提供了新的选择。研发的CSFV阻断ELISA抗体检测试剂盒经试验证明,其敏感性、特异性和稳定性良好,可以应用于临床疫苗免疫后抗体水平监测和流行病学调查的工作中。用猪瘟疫苗免疫猪,在免疫后0,7,14,21,28,35,50天收集血清样品,应用重组E2蛋白作为抗原建立的阻断ELISA方法检测E2蛋白抗体消长;分别使用重组E0和C蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法,检测免疫过程中抗两种抗原的血清抗体变化特征。抗体检测结果显示:疫苗免疫后第7天即可在血清中检测到抗结构蛋白E2、E0和C的相应抗体,其中针对E2和E0抗原的抗体在免疫后第21天时达到最高水平,E2抗体水平总体呈现先上升后下降的变化趋势;抗E0抗原的抗体在免疫后21天之后有所下降并最终趋于稳定状态;C蛋白抗体在第7天时出现,随后开始下降,在第28天转为阴性。应用建立的ELISA血清抗体检测方法分析疫苗免疫后针对3种结构蛋白的抗体变化特点,可为兽医临床CSF疫苗免疫程序的制定提供有意义的数据参考。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.4
【部分图文】：

.1.2.6 RT-PCR 方法检测猪瘟疫苗免疫后在猪体内的代谢情况使用猪外周血淋巴细胞分离液试剂盒从疫苗免疫后定期采得抗凝血中分离外周血淋巴细胞提取总 RNA，利用 RT-PCR 方法扩增 CSFV E2 基因。1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，胶回收目的基因片段进行序列测定与分析。.2 结果与分析.2.1 猪瘟病毒阻断 ELISA 抗体检测试剂盒的稳定性研究4 ℃试验组 OD450nm 值和阻断率结果如图 2.1 所示；37 ℃加速热稳定性试验组 OD450nm阻断率结果如图 2.2 所示。在两组试验过程中，阳性对照和 2 份已知阳性血清的 OD450nm 值有显著变化，但阴性对照和 2 份已知阴性血清的 OD450nm 值有显著下降。根据检测结果 Om 值计算阻断率，结果显示：在试验过程中，阳性对照和 2 份已知阳性血清的阻断率一直在，但一直高于临界值 40% 阻断率，而 2 份已知阴性血清的阻断率一直低于临界值。此外，个试验过程中，阴性对照血清的 OD450nm 值总不小于 0.5，阳性对照血清的阻断率总高于 40足试剂盒结果成立的有效性标准。

图 2.2 37℃试验组血清 OD450nm 值 (C) 和阻断率 (D) 变化情况Fig.2.2 Changes of the OD450nm value (C) and the blocking ratio (D) of sera in 37 C group.07425-1 和 07425-6 是已知的 CSFV 抗体阴性血清；07425-3 和 07425-4 是已知的 CSFV 抗体阳性血清。Figure D 中黑色横线代表临界值 40% 阻断率。07425-1 and 07425-6 were known CSFV antibody-negative sera; 07425-3 and 07425-4 were known CSFV antibody- positive sera. The black lineshown in the figure D represents a cut-off value of 40% of the blocking ratio.2.2.2 猪瘟病毒阻断 ELISA 抗体检测试剂盒的特异性利用猪瘟病毒阻断 ELISA 抗体检测试剂盒检测 PCV2、PRRSV、PRV 和 BVDV 阳性血清，分别计算其阻断率。结果显示：PCV2、PRRSV、PRV 和 BVDV 阳性血清的检测结果均为阴性(表2.1)。表明该试剂盒特异性良好。表 2.1 交叉反应试验结果Table 2.1 Results of the cross-reaction test阳性血清（Positive sera）PCV2 PRV PRRSV BVDV

图 2.3 血清 IFA 检测结果Fig.2.3 Results of the sera detected by IFA.T 细胞接毒 48 h 后处理细胞进行 IFA 试验，用 DAPI 染细胞核，从样本中检测到的特异性免疫染色代表血清样本中存在 C体。放大倍数 40 ×。ST cells were harvested at 48 h.p.i and processed for IFA. All nuclei were stained with DAPI. Specific immunostaining detected frosample indicated the presence of CSFV antibodies in serum samples. Magnification is 40×.表 2.4 117 份血清的 IFA 试验结果Table 2.4 Summary of the 117 inconsistent sera detection results by IFA81 IDEXX ELISA - / bELISA + samples 36 IDEXX ELISA + / bELISA – sample 54 10 27 26.5 RT-PCR 方法检测外周血淋巴细胞中 CSFV E2 结果在疫苗免疫后第 7 天和第 14 天的 8 头实验猪样品中均可以扩增得到大小约 700 bp 的基图 2.4），目的基因片段切胶回收序列测定的结果在 GenBank 中比对证实确为猪瘟病毒
【参考文献】

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本文编号：2853913