鸡柔嫩艾美耳球虫钙结合蛋白EtCaBP免疫原性研究

发布时间：2020-11-01 15:07

　　 鸡球虫病是鸡球虫寄生在鸡的小肠及盲肠上皮细胞内引起的的专性寄生虫病,给养禽业造成巨大经济损失。目前药物防治和疫苗预防措施均无法使防治球虫病达到理想的效果。因此,寻找抗原性较好的蛋白去研制廉价高效的新型疫苗成为防治球虫病的关键。本研究中ETH_00009450是通过蛋白质组学分析筛选出,并分析到该基因在鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)入侵DF1细胞时其表达量上调了1.569倍,本研究选取此基因开展研究。首先对EtCaBP基因进行一系列生物学分析,从该基因的氨基酸序列二级及三级结构的分析显示该基因表达蛋白为钙结合蛋白(CaBP),具有特征性的EF-hand钙结合结构域,它们能与钙离子发生作用,在细胞内钙信号转导及钙稳态等各种生命活动机制中发挥重要作用。因此推测该基因是否与球虫入侵宿主细胞相关,从而研究该蛋白的免疫原性,为研究防治鸡球虫病新型疫苗提供候选蛋白的筛选。对EtCaBP(Eimeria tenella钙结合蛋白)生物学信息分析后,本研究通过PCR扩增获取基因片段,经再经NcoⅠ和HindⅢ酶切后克隆至原核表达载体pET32a-EtCaBP,转化到大肠杆菌表达菌BL21(DE3)菌株中,经IPTG诱导表达并纯化EtCaBP蛋白,制备亚单位疫苗,免疫小鼠后制备出鼠源多克隆抗体。构建酵母表面展示系统将EtCaBP蛋白展示在酵母表面,鉴定制备的多克隆抗体。本研究通过鸡球虫感染试验对EtCaBP亚单位疫苗的免疫效果进行了评价,从而探究EtCaBP蛋白的免疫原性。将120只个体差异不大的雏鸡随机分成A组(EtCaBP免疫接种球虫组)、B(EtCaBP免疫不接种球虫组)、C(不免疫接种球虫组)、D组(不免疫不接种球虫组),每组30只。7日龄时,用完全弗氏佐剂乳化后的蛋白对A、B两组进行颈部皮下多点注射免疫,免疫量为100ug/只,C、D两组注射等量PBS;14日龄时,用不完全弗氏佐剂乳化蛋白进行第二次加强免疫,免疫方法同7日龄;21日龄时,对A、C两组接种10000个新鲜的E.tenella孢子化卵囊。结果表明EtCaBP蛋白无跨膜区但具有信号肽序列,二级结构预测显示主要以α螺旋为主,含有5个EF-hand钙结合结构,通过三级结构预测发现与CBP40(Physarum polycephalum特异性Ca~(2+)结合蛋白LAV1-2)结构相似,相似度为66%。本研究成功克隆出EtCaBP基因,并构建原核表达载体表达出可溶性蛋白,纯化蛋白成功制备鼠源多克隆抗体。31日龄,整理数据进行结果分析,通过对比组间的体重增长、相对增重率、卵囊排出量、盲肠病值、抗球虫指数、淋巴细胞转化、细胞因子荧光定量分析等指标对EtCaBP亚单位疫苗的免疫保护效果进行了评价。EtCaBP免疫接种组的相对增重率、卵囊值、盲肠病变值和抗球虫指数分别为88.9%、10、23.7、155.20。结果显示EtCaBP蛋白免疫后一定程度上可以减少E.tenella感染对鸡体重增长的抑制作用,减少卵囊排出量和减轻病变程度,抗球虫效果是有效的。综上所述,EtCaBP蛋白具有钙结合蛋白的EF-hand钙结合结构域,具有一定的免疫原性,对鸡感染球虫有一定的免疫保护作用。
【学位单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.723
【部分图文】：

典型钙结合蛋白EF手型结构域中常见氨基酸（ZhouYetal.,2006）

图 2 典型钙结合蛋白 EF 手型结构域中常见氨基酸（Zhou Y et al., 2006）Fig2 Consensus sequence of canonical Ca2+binding protein EF-hands对来自寄生原虫溶组织阿米巴（Entamoeba histolytica）的 EhCaBP6 及其它分子钙结合蛋白进行氨基酸序列比对，总结了溶组织阿米巴原虫 12 种钙结合蛋白 EF 构域中常见氨基酸的分布规律，X、Y、Z、-Y、-X、-Z 分别位于结构域环状结、3、5、7、9、12 位氨基酸残基上，以 I 型 EF 手型结构为例，可见 1(X)、3(Y))大多为 D 天冬酰胺；9(-X) 大多为 S 丝氨酸或 T 苏氨酸，12(-Z)大多为 E 谷氨酸Ⅲ、Ⅳ型 EF 手型结构的重要氨基酸分布略有不同。EhCaBP6 在溶组织阿米巴原分裂时分布于细胞间桥，在分裂间期位于多极微管束的末端（Grewal J S et al., 201

实验动物i TOP10 用于重组质粒的筛选，BL21（DE3）菌株用存；酿酒酵母 EBY100 [MATa GAL1-AGA1::URA3::HIS2 prb1Δ1.6R can1 GAL]和酵母表达载体 pCTC 教授馈赠。E. tenella 分离株（E. tenella SD-01）由无球虫感染鸡扩增、复壮。试验小白鼠购自泰邦生兰褐公雏购自泰安市东岳种禽厂。酶和试剂的所有引物均由上海生工生物有限公司合成。全式金生物公司，载体 pEASY-T1 质粒图谱如图 4
【参考文献】

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本文编号：2865709