湖羊羔羊F17大肠杆菌腹泻与非腹泻个体脾脏长链非编码RNA分析

发布时间：2020-11-04 13:39

　　 随着人们消费水平的提高,羊肉因其肉质细嫩、易消化、富含蛋白质和维生素等特点而越来越受广大消费者的青睐。羊大肠杆菌病因为其发病率高和其所导致的死亡率高,给养羊业带来了巨大的经济损失。传统使用抗生素治疗的方法存在多种缺陷,而从遗传学入手,可为提高和改善湖羊抗病能力提供新思路。本试验以湖羊为研究对象,通过组织块法及单克隆法,分离纯化湖羊小肠上皮细胞,并通过细胞角蛋白18免疫荧光鉴定法来分析鉴定;对湖羊羔羊口服F17大肠杆菌菌株获得非腹泻和腹泻型个体,利用RNA-seq筛选出差异1ncRNA(DE 1ncRNAs),并用RT-qPCR验证它们的相对表达水平,GO和KEGG富集分析以及1ncRNA-mRNA互作分析,进一步筛选关键DE 1ncRNAs;检测TCONS 00089751在湖羊心、肝、脾、肺、肾、空肠、回肠、十二指肠组织的表达量,构建TCONS 00089751过表达载体并转染湖羊小肠上皮细胞,RT-qPCR检测EFB41L2、FUT1/2、CDK1、CDK2、CDK4和 CASP3 的表达量,通过 CCK-8 检测 TCONS 00089751对小肠上皮细胞增殖的影响,通过凋亡试验检测其对小肠上皮细胞凋亡的影响,利用Miranda预测与TCONS 00089751竞争性结合的miRNA,进一步筛选并通过双荧光素酶报告验证靶向关系。主要研究结果如下:1.体外分离了湖羊小肠上皮细胞,显微镜中观察到湖羊小肠上皮细胞呈椭圆型,细胞之间紧密相连,细胞形态一致。经免疫荧光检测发现小肠上皮细胞的特异性抗体角蛋白18抗原呈阳性表达,表明成功分离得到湖羊小肠上皮细胞,为后续进行功能验证提供了材料。2.利用RNA-seq,对腹泻型与非腹泻型羔羊个体的脾脏组织进行测序,共筛选出DE 1ncRNAs 34个,随机选择6个DE 1ncRNAs,用RT-qPCR验证它们在腹泻组和非腹泻组羔羊脾脏组织中的相对表达水平,发现两组间存在显著差异(P0.05)。通过GO和KEGG Pathway富集分析,结果表明34条DE 1ncRNAs被注释和分类到302个功能亚类和149个KEGG通路中。通过1ncRNA-mRNA相互作用网络分析,筛选了 5个1ncRNAs,以及6个可能被其相关1ncRNA调控的基因:MYO1G、71MM29、CARM1、EPB41L2、SEPT4、DESI2。3.检测了 TCONS 00089751在各组织中的表达量,发现除心脏组织外,其余各组织中,非腹泻组中TCONS 00089751的表达量均高于腹泻组,且几乎都达到显著水平。过表达TCONS_00089751发现,EPB41L2表达量显著变化,黏附相关基因FUT1/2表达量显著下调;细胞增殖相关基因CDK1、CDK2和CDK4表达量下降但不显著;凋亡相关基因CASP3显著上调;CCK-8试验结果显示TCONS_00089751对湖羊小肠上皮细胞的增殖没有明显作用;凋亡试验结果显示TCONS_00089751促进湖羊小肠上皮细胞的凋亡。利用Miranda共预测出9个可能与TCONS_00089751竞争性结合的miRNA,通过双荧光素酶报告试验发现TCONS_00089751与oar-miR-541-3p和oar-miR-134-3p存在靶向关系。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.26
【部分图文】：

６?扬州大学硕士学位论文???３．３．１?ＩｎｃＲＮＡ和染色质调节??通过调节染色质，ＩｎｃＲＮＡ已成为调控转录的重要参与者［４８＿５（）］。ＩｎｃＲＮＡｓ在不同的功??能中调节染色质结构，包括组蛋白修饰，ＤＮＡ甲基化和染色质重塑。在广泛的进化谱中，??尽管ＩｎｃＲＮＡ缺乏一级序列的保护，但它们在染色质调节功能中仍体现了其保守作用。??３．３．２?ＩｎｃＲＮＡ通过组蛋白修饰调节染色质结构??ＩｎｃＲＮＡ与组蛋白修饰复合物（ＰＲＣ１尤其是ＰＲＣ２）的相互作用非常突出，图１－２?ａ??描述了?ＩｎｃＲＮＡ调控组蛋白修饰的一般机制。??３染色质重塑／组蛋白修饰?卜ｃ??Ｃ?ＳｔａｕｆｅｎｍＲＭ衾

ＰＢＳ轻洗３次，每次约５?ｍｉｎ，以防细胞脱落。??的马血清，室温封闭３０ｍｉｎ，弃血清。??（Ａｎｔｉ－Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ?１８，１：?１００），４°Ｃ，过夜。??轻洗３次，５?ｍｉｎ／次，加入ＦＩＴＣ标记的羊抗鼠二抗（１：３次，５?ｍｉｎ／次，加入ＤＡＰＩ染色，室温５?ｍｉｎ，注意避３次，５?ｍｉｎ／次，最后用蒸馏水清洗１次，荧光显微镜观皮细胞的原代培养??分离培养细胞，７？１〇天时得到的细胞如图２－１所示，组辐射。在倒置显微镜下观察到，成纤维细胞呈扁平状，种细胞混杂生长。??

４．２湖羊小肠上皮细胞的纯化与克隆??将细胞稀释至大约１个／孔铺入９６孔板，培养７天时可在显微镜下观察到细胞集中??生长，如图２－２所示，９６孔板中的细胞贴壁生长，细胞与细胞之间紧密相连，且细胞形??态一致。??ｒ國響關??ｍ?．，??图２－２用单克隆法获得湖羊小肠上皮细胞（５〇ｘ）??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ?ｓｍａｌｌ?ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ?ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ?ｃｅｌｌｓ?ｆｒｏｍ?Ｈｕ?ｓｈｅｅｐ?ｂｙ?ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ?ｍｅｔｈｏｄ?（５０＞Ｏ??４．３湖羊小肠上皮细胞的鉴定??通过对细胞角蛋白１８抗原和细胞核分别进行染色，在显微镜下看到的结果如图２－３??所示，然后将两者进行融合，细胞表面发出绿色荧光，表明试验培养得到的细胞为湖羊??小肠上皮细胞。???图２－３细胞角蛋白１８免疫荧光鉴定??Ｆｉｇｕｒｅ?２－３?Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ?１８?ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ??
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本文编号：2870160