牛大肠杆菌

发布时间：2020-11-12 08:35

　　致泻性牛大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是引起犊牛腹泻疾病(Neonatal calf diarrhea,NCD)的主要病原,对犊牛的发育、生长、成活等造成很大的影响;牛多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,PM)会导致牛发生全身出血性败血症和牛呼吸道综合征,也可导致腹泻,该菌主要表现为混合感染和继发感染,偶尔也有急性发病。这两种菌在国内牛场中普遍存在,两者之间经常发生混合感染,从而加剧腹泻病的发生,给奶牛和肉牛产业造成巨大经济损失。我国目前尚未有针对牛大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌病的联合疫苗,本研究利用从临床上分离的致病性牛大肠杆菌病原和牛多杀性巴氏杆菌病原,通过对病原进行鉴定,建立菌种种子批,研制出二联灭活疫苗,用于预防牛的大肠杆菌病和多杀性巴氏杆菌病。同时通过摸索疫苗的大生产工艺条件,完善疫苗的质量特性研究,使研制的疫苗具有临床应用价值,为疫苗的产业化提供基础。首先本研究从患有腹泻疾病的犊牛上分离到两株细菌,通过生物学鉴定为O101:K99致病性牛大肠杆菌病原和荚膜B群牛多杀性巴氏杆菌,分别命名为E0803株和P0604株。毒力试验结果显示E0803株对小鼠的LD_(50)为9×10~6 CFU,无法使新西兰兔致病;P0604株对小鼠和新西兰兔的MLD均低于10 CFU。小鼠免疫原性试验表明,对照组小鼠全部死亡时,E0803株免疫组能获得80%的保护率,P0604株免疫组可获得100%的保护率,提示两株菌株均具有良好的免疫原性,可作为制备疫苗的候选菌株。建立了两株菌株的种子批,不同代次菌株的生物学特性研究结果显示,两株菌株F1~F20各代次之间的培养特性、形态及纯粹性均保持一致,F1、F10、F20各代次菌株生化特性、毒力和免疫原性均无明显差异。实际应用中建议将两株菌株的第1~4代作为原始种子代次,第5~10代作为基础种子代次,种子继代培养控制在5代以内。在二联灭活疫苗的生产工艺研究方面,对培养基选择、培养时间、培养时血清添加量、大生产工艺条件、灭活工艺、乳化工艺等进行研究,确定两株菌株均可采用TSB进行生产。在大生产发酵过程中,两者的培养条件均为37℃下培养10 h,罐压0.03 MPa,其中E0803株可调节搅拌转速200 r/min,P0604株采用搅拌转速100r/min,同时在培养时添加2%~5%的血清进行培养。确定两株菌株大生产时的最佳灭活条件为采用0.2%甲醛溶液,在37℃条件下灭活24~36 h。确定疫苗配苗水油比例为1:2,小型乳化机乳化条件为8000 r/min乳化5 min,中大型乳化机乳化条件为4000r/min乳化20 min。在疫苗安全性方面,同时采用新西兰兔和小鼠进行牛大肠杆菌病、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的安全性研究。结果显示,牛大肠杆菌病、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗对兔和小鼠进行超剂量一次接种及单剂量重复接种均安全,动物接种疫苗后没有出现因疫苗引起的不良反应;采用小鼠替代靶动物建立二联灭活疫苗的效力检测方法,小鼠免疫后进行攻毒,结果显示,小鼠免疫疫苗后14日可产生免疫力,免疫21日后小鼠用强毒攻击能获得80%以上的保护,表明本课题研究的牛大肠杆菌病、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗具有良好的安全性和有效性。上述研究成果为牛大肠杆菌病、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的研制提供了科学的实验数据,为疫苗的产业化提供基础。
【学位单位】：佛山科学技术学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.4
【部分图文】：

大肠杆菌,枸橼酸盐,多杀性巴氏杆菌

15图2-1 大肠杆菌在TSA培养图图2-2 多杀性巴氏杆菌在鲜血琼脂培养图图2-3 大肠杆菌革兰氏染色图图2-4 多杀性巴氏杆菌革兰氏染色图2.3.2 生化反应生化反应结果（表2-3）显示，E0803株能发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、山梨醇和甘露醇，不能发酵卫茅醇和肌醇，MR试验阳性，枸橼酸盐、明胶液化、H2S和VP试验为阴性。P0604株能发酵葡萄糖、蔗糖、山梨醇和甘露醇，不能发酵乳糖、麦芽糖、鼠李糖、卫茅醇和肌醇，明胶液化、H2S试验阳性，枸橼酸盐、MR和VP试验为阴性。从生化试验结果可以看出，E0803株符合大肠埃希菌的生化反应特性

多杀性巴氏杆菌,枸橼酸盐,肌醇,山梨醇