菌群移植对新生仔猪肠道发育的影响

发布时间：2020-11-13 02:23

　　 猪是由宿主和微生物共同构成的超级生物体。肠道微生物种类超过千种,细胞总数为10~(14),是宿主自身细胞数的5-10倍。因此研究猪营养离不开肠道微生物的影响,特别是在仔猪发育早期阶段。微生物定植与肠道发育密切相关,这种影响将决定猪后期的生长性能和健康状况。无菌小鼠上的研究发现不同时间阶段定植微生物,对宿主的发育影响有显著差异。因此,本课题重点关注两个问题:一、不同阶段进行微生物干预对仔猪生长发育有何影响;二、利用无菌猪模型研究微生物干预对仔猪肠道发育的影响。试验一重点研究不同时间段进行菌群早期干预对仔猪生长发育的影响。试验将成年母猪菌群在3日龄和7日龄分别移植于新生仔猪,以正常饲喂的新生仔猪作为对照组。研究早期菌群移植对仔猪生长、腹泻发生、肠道形态发育、肠道菌群结构及其代谢产物组成的影响。仔猪生产性能测定结果表明,3日龄和7日龄菌群移植均能改善普通仔猪日增重,但由于3日龄组初生体重最低且试验周期较短,所以还未体现出与对照组的显著差异。仔猪出生后,3日龄组和7日龄组的平均体重极显著低于对照组,且3日龄组极显著低于7日龄组;28日龄屠宰前,3日龄组和7日龄组的平均体重均高于对照组,且7日龄组极显著高于3日龄;整个试验期间,与对照组相比,3日龄组和7日龄组的平均日增重显著升高,且7日龄组极显著高于3日龄。试验过程中的腹泻率统计发现菌群移植有助于降低仔猪腹泻发生。3日龄组和7日龄组的腹泻发生率均低于对照组,且3日龄组腹泻发生率显著低于7日龄组。进一步通过HE染色观察仔猪十二指肠和空肠组织结构,发现菌群移植对十二指肠肠绒毛结构发育影响不显著,对空肠形态发育影响显著。与对照组相比,3日龄组和7日龄组的空肠绒毛高度升高,且3日龄组显著高于7日龄组;3日龄组的空肠隐窝深度极显著降低,7日龄组显著降低;相比对照组而言,3日龄组肠绒毛与隐窝的比值(绒腺比)极显著升高,7日龄组极显著降低。通过16S rRNA测序技术分别测定3组在菌群接种前后的菌群差异,结果表明3日龄组和7日龄组菌群移植有利于肠道菌群多样性增加,并增加益生菌数量,减少条件致病菌比例。与菌群移植前相比,3日龄组的厚壁菌门的比例极显著升高,变形菌门的比例显著降低;7日龄组和对照组无显著变化。具体到属水平,3日龄组的有益菌属Lactobacillus和Ruminococcaceae_UCG-002的相对丰度显著升高,Dialister、Peptostreptococcus和Acidaminococcus极显著升高;致病菌属Escherichia-Shigella极显著降低;7日龄组和对照组无显著差异。利用GC-MS的方法检测仔猪结肠内短链脂肪酸(Short chain fatty acids,SCFAs)的含量,结果表明菌群移植有助于肠道SCFAs的生成。与对照组相比,3日龄组和7日龄组仔猪结肠内的SCFAs含量均有所上升;3日龄组中丙酸和异丁酸上升显著;7日龄组除异丁酸极显著降低外,其余上升均不显著。结果表明,早期菌群移植能改善普通仔猪日增重,降低腹泻率,改善普通猪肠绒毛的发育;3日龄菌群移植可显著增加结肠内厚壁菌门和拟杆菌门等有益微生物比例,减少变形菌门等条件致病菌数量,增加SCFAs含量。综合分析,3日龄菌群移植对肠道发育的影响更为显著。试验二主要利用无菌猪模型研究菌群移植对仔猪肠道发育的影响。在无菌猪3日龄时进行菌群移植,以不添加处理的无菌猪作为对照组,研究菌群移植对仔猪肠道微生物屏障、化学屏障、物理屏障和免疫屏障四大屏障的影响。通过16S rRNA测序技术测定移植菌群在无菌猪上的重现率,结果发现移植菌群可以在无菌猪上较好重现。在门水平上,无菌仔猪定植的菌群结构和比例与菌悬液(Fecal Bacterial Biopreparate,FBB)组成和供体母猪菌群(Donor sows,D_SOW)相似,且丰度最高的拟杆菌门和厚壁菌门无显著差异;在属水平上,无菌仔猪菌群移植后的肠道菌群结构和比例与D_SOW和FBB组成相近,且丰度最高的拟杆菌和大肠杆菌两个菌属差异不显著。通过GC-MS方法测定仔猪结肠内SCFAs含量,结果显示移植菌群有助于菌群代谢产物SCFAs的产生。FMT组仔猪肠道中乙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸以及总SCFAs含量均比GF组显著升高。HE染色测量仔猪空肠组织结构的变化,结果表明FMT有助于仔猪空肠绒毛发育。FMT组空肠绒毛高度显著增长,隐窝深度极显著变浅,绒腺比比值显著增大;且G组仔猪肠上皮中杯状细胞数目极显著高于FMT组。通过Western blot技术进一步探究机体肠道物理屏障是否改变,结果显示FMT促进肠道紧密连接蛋白表达。FMT组的ZO-1蛋白和Occludin蛋白表达量均比G组有所升高,且ZO-1蛋白差异显著。通过RT-qPCR定量肠道稳态相关细胞因子的表达。结果显示,FMT后空肠组织内接受抗原刺激的受体基因TLR2、TLR4表达量有所上升;FMT组的黏膜保护因子TFF3基因的表达量与GF组几乎一致;肠道抗菌肽Reg3γ基因的表达量显著高于GF组,约为GF组的153倍;炎症性疾病的关键因子IL-22基因的表达量上升为G组的15倍。上述结果表明,移植菌群能在无菌猪模型上较好的重现,促进肠道微生物屏障的形成;无菌猪菌群移植能增加肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达,改变肠绒毛形态,促进肠道物理屏障的形成;菌群移植可提高结肠内SCFAs的含量,促进肠道化学屏障的形成;菌群移植可增加抗病相关的细胞因子表达,促进肠道免疫屏障的形成。综上所述,早期菌群移植可改善仔猪的生长发育,且3日龄菌群移植效果优于7日龄;利用无菌猪的模型研究表明,菌群移植有助于仔猪肠道的微生物屏障、物理屏障、化学屏障和免疫屏障的构建。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S828.5
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 文献综述
    1.1 微生物早期定植对肠道微生态的影响
    1.2 菌群干预方法—菌群移植技术
    1.3 菌群干预研究模型—无菌猪
    1.4 本研究的研究思路
    1.5 本研究的技术路线
第2章 研究内容与结果
    试验一 不同时间点菌群移植对仔猪发育的影响
        2.1.1 前言
        2.1.2 试验材料与方法
        2.1.3 研究方法
        2.1.4 试验结果
        2.1.5 讨论
    试验二 无菌猪模型验证菌群移植对仔猪肠道发育的影响
        2.2.1 前言
        2.2.2 试验材料
        2.2.3 研究方法
        2.2.4 试验结果
        2.2.5 讨论
第3章 结论与研究展望
参考文献
致谢
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