宿主蛋白DAZAP2对乙型脑炎病毒增殖与复制的影响研究

发布时间：2020-11-14 17:33

　　 日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)的NS1蛋白是其重要的非结构蛋白,在病毒的增殖、复制、装配、免疫逃避等方面发挥重要作用。前期研究发现宿主蛋白DAZAP2是NS1蛋白的互作蛋白之一,本研究旨在探究宿主蛋白DAZAP2对乙脑病毒的增殖复制是否有影响,进一步揭示宿主蛋白DAZAP2在乙脑病毒增殖与复制中发挥的作用。首先,构建DAZAP2基因的靶向干扰质粒和DAZAP2基因敲除细胞系及检测用标准曲线。研究中成功构建针对DAZAP2基因的靶向干扰质粒,最高干扰效率达53.7%;运用CRISPR/Cas9技术成功构建DAZAP2基因敲除细胞系;成功构建了用于检测干扰质粒转染水平、DAZAP2基因表达情况、评价JEV mRNA水平的NS1基因、E基因及细胞内参β-actin的荧光定量标准曲线,R~2均大于0.99;其次,对DAZAP2蛋白的表达抑制干扰发现其正向调节了JEV的mRNA和子代病毒粒子水平。干扰293细胞上宿主蛋白DAZAP2的表达后,相对荧光定量和WB检测显示JEV增殖复制无明显变化,推断可能由于shRNA的靶向位点的沉默效率不够;在DAZAP2基因敲除细胞系上,接种JEV,运用相对荧光定量、WB及蚀斑分析,发现JEV mRNA水平较对照组提高约1.6倍,子代病毒滴度为6.35 pfu/ml,为对照组的1.27倍,但在该细胞系上转染乙脑病毒复制子,运用相对荧光定量和WB检测,未见明显变化。最后,DAZAP2蛋白过表达发现其影响了JEV mRNA水平。通过相对荧光定量和WB分析,证实过表达宿主蛋白DAZAP2后,感染JEV,其JEV mRNA相较对照组提升约3倍,mRNA水平显著提高。综上结果证实了293细胞的蛋白DAZAP2是一种对JEV的增殖与复制有影响的重要宿主蛋白。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

图 1-1 乙脑病毒的主要分布及基因型[10]Fig.1-1 Genotype spread of JEV[10]病毒颗粒为球形，基因是单股正链 RNA，病毒基因全长约 11kb（图 1-2毒的 3 种结构蛋白（分别为：C、PrM 和 E）和 7 种非结构蛋白（分别为：S2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5）[9]。目前研究发现乙脑病毒 C 蛋白S3 蛋白和 NS5 蛋白与病毒的增殖复制相关。Tsuda[11]等和 Katoh[12]等研 蛋白能够进入细胞核后参与病毒基因组的复制。Liu 等[13]通过 RNA 干 蛋白的表达能够达到抑制乙脑病毒复制的效果。Chen 等[14]研究证实 JE白与病毒的复制有密切关联。随后又有学者陆续报道 NS3 和 NS5 对 JE响，如 Yuan 等[15]通过 RNA 干扰技术证明了 JEV NS3 蛋白对 JEV 的增。，近年的研究表明，JEV 蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用对病毒入侵、

图 1-2 乙脑病毒的结构[10]Fig.1-2 JEV structure[10]蛋白对黄病毒增殖与复制的影响作为一类结构较简单的 RNA 病毒，大量研究证实病毒的复制不仅需形成的复制复合体的作用，更需要大量宿主蛋白的参与。这些宿主蛋制、病毒蛋白翻译修饰、复制复合体形成等方面发挥重要功能。蛋白与 JEV 病毒蛋白相互作用对病毒增殖与复制的影响衣壳蛋白（Capsid protein），能够进入细胞核后参与病毒基因组的复制， 通过 JEV C 蛋白的 Glv42 和 Pr043 位点与宿主细胞核仁上的蛋白进病毒 RNA 复制和病毒蛋白表达。Katoh[12]等通过质谱分析和 PullnRNPA2 能与 C 蛋白及病毒基因组相互作用，正向调控病毒的复制

过设计乙脑病毒 NS1 蛋白的多种干扰质粒，研究 NS1 蛋白受干扰后，乙脑的病毒复制被抑制。Lei Yuan[48]等通过设计 的靶向沉默位点，构建 shRNA，沉默 NS3 和 NS4A 蛋白的被抑制。Qingqiang Xu[49]等通过运用 siRNA 沉默宿主蛋白 N4 能够促进 JEV 病毒的复制。用 RNAi 特异性地抑制宿主基现研究基因基因的重要功能，已经取得显著成果[37, 38]，RN能的工具。辑技术的研究及应用是基于目标基因的 DNA 双链断裂[50]，对细胞基因组中目的、剪切、增加或者插入外源基因序列[51-53]。自 1979 年在酵0 年的时间，在学者的不懈努力和研究下，基因编辑技术已（图 1-3）[54]。
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本文编号：2883754