单增李斯特菌双组分信号系统的组氨酸激酶与毒力相关性研究

发布时间：2020-11-20 23:35

　　 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenges,Lm)简称单增李斯特菌,属革兰氏阳性菌,是WHO划定的重要食源性病原菌,导致人兽共患病——李斯特菌病(Listeriosis)。Lm适应性较强,在自然界环境中是腐生菌,但侵入动物机体后就摇身变成了致病菌。由感应外界信号的组氨酸激酶(Histidine kinase,HK)和调控胞内相关基因表达的应答调控子(Response regulator,RR)组成的细菌双组分信号系统(Two-Component Signal Transduction System,TCS)是细菌适应环境的重要调控系统。研究发现,Lm侵入机体变成致病菌,这种角色的转变与Lm的TCS中的有些RR密切相关,但与负责感应外界信号的HK的相关性的报道则鲜见。因此,本研究以Lm的HKs为研究对象,探究HKs与Lm的毒力的相关性,从而为进一步了解Lm的致病性及预防和治疗李斯特菌病提供理论依据。本课题组对Lm食品分离株LM201进行了全基因组测序和分析,搜索、分析和总结了LM201中的TCSs,得知LM201共有14对HK/RR和两个孤儿RR。本研究以LM201为材料,分别成功构建了13株HK的缺失菌株,对缺失株进行了生长曲线测定、细胞实验和小鼠毒力测定,具体实验结果如下:1.HK缺失株的构建以温敏自杀性质粒pHT304-ts为载体,用同源重组的方法成功构建了13株LM201的HK缺失株,分别是S0106(?cheA)、S0132(?cesK)、S0142(?phoR)、S0152(?hssS)、S0162(?kdpD)、S0172(?agrC)、S0182(?liaS)、S0192(?lisK)、S01A2(?yclK)、S01B2(?resE)、S01C2(?eutW)S01D2(?virS)和S01E2(?yesM)。2.缺失株生长曲线测定对13株缺失株进行37℃生长曲线测定,结果显示,菌株S0106(?cheA)、S0142(?phoR)、S0162(?kdpD)和S0172(?agrC)在稳定期时细菌量低于亲本株LM201,其他缺失株与LM201生长趋势一致。对13株缺失株进行5℃生长曲线测定,结果发现,与亲本株LM201相比菌株S0192(?lisK)的生长速度变缓慢,其他缺失株与LM201生长趋势一致。3.缺失株细胞实验结果13株缺失株上皮细胞Caco-2(结肠腺癌细胞)细胞实验结果表明,与亲本株LM201相比,S0192(?lisK)、S01D2(?virS)和S01E2(?yesM)的黏附与侵袭能力均显著下降,S0106(?cheA)和S01A2(?yclK)的黏附能力显著上升,S01B2(?resE)和S01C2(?eutW)的侵袭能力显著上升。HBMEC(人脑微血管内皮细胞)细胞实验结果显示,S0182(?liaS)的黏附与侵袭能力与亲本株LM201相比均显著上升,S0132(?cesK)和S01B2(?resE)黏附能力显著下降,S0172(?agrC)的侵袭能力显著上升。RAW264.7细胞(小鼠巨噬细胞)实验结果显示,与亲本株LM201相比,缺失株S01D2(?virS)、S01B2(?resE)和S01C2(?eutW)在细胞中的细菌量显著下降,说明基因virS、resE或eutW缺失会导致Lm在RAW264.7细胞中的存活能力减弱。4.缺失株的小鼠实验结果对13株缺失株进行了小鼠组织载菌量实验,结果显示,S0172(?agrC)在24h肝脏载菌量显著下降,48h肝脏和脾脏载菌量显著上升,72h肝脏和脾脏载菌量又显著下降。S0192(?lisK)在24h和48h的肝脏和脾脏载菌量均显著下降。S01E2(?yesM)在48h肝脏和脾脏载菌量显著下降,在72h脾脏载菌量显著下降。13株缺失株半数致死量(LD_(50))测定结果显示,菌株S0152(?hssS)、S0172(?agrC)和S01D2(?virS)与亲本株LM201(LD_(50)为2.08×10~5)相比LD_(50)上升较高,分别为9.84×10~5、10.37×10~5和9.78×10~5,其毒力与LM201相比分别下降4.73、4.99和4.70倍。菌株S0142(?phoR)、S0162(?kdpD)和S0182(?liaS)的LD_(50)分别为8.4×10~4、1.18×10~5和1.24×10~5,与LM201(LD_(50)为2.08×10~5)相比毒力上升。综合以上结果,发现13个HK中HssS、AgrC、LisK、VirS或YesM缺失导致Lm的毒力下降,LiaS缺失导致Lm毒力上升。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

单增李斯特菌双组分信号系统的组氨酸激酶与毒力相关性研究现出轻微的类似流感的症状。而对于抵抗力低下的易感机都比较相似，如出现呼吸急促、昏迷、胃肠炎、化脓性结状，严重者可导致死亡（Sleator and Hill 2006）。研究表明炎，脑干脑炎，脑膜脑炎等是造成死亡的主要原因（D

单增李斯特菌双组分信号系统的组氨酸激酶与毒力相关性研ATP 结合以便 HK 获得磷酸集团自身磷酸化（Bhate et a内，其位于 N 端的信号接收结构域（receiver domain,来接收来自 HK 的磷酸集团；C 端效应结构域（effectorA、RNA 或蛋白质结合，从而调节细胞行为以便做出正

单增李斯特菌双组分信号系统的组氨酸激酶与毒力相关性研究 缺失突变株的构建源臂的 PCR 扩增及上下游同源臂 Over-lap 连接LM201 为模板扩增目标基因的上下游同源臂，用 0.8%~1%的琼脂糖的条带，将扩增得到的正确的上、下游同源臂片段回收，用 Over-标基因的上下游同源臂融合起来，融合产物用 0.8%~1%琼脂糖凝胶大小与上下游同源臂融合后的片段一致，如图 4-1。
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