新孢子虫酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcGRA7的构建及其与Vero细胞相互作用蛋白的初步筛选

发布时间：2020-11-21 11:03

　　 新孢子虫病是由犬新孢子虫寄生于牛、羊和犬等多种动物有核细胞内引起的一种原虫病。机体感染犬新孢子虫后几天内会发生的坏死性病变,并通过细胞内速殖子的增殖导致细胞死亡。典型症状是母畜流产,死胎以及新生胎儿运动障碍。该病是一种世界范围性的疾病,分布广泛,在澳大利亚,日本,韩国以及我国的多个省份都有发现,给畜牧业的经济发展带来了巨大影响。但现今仍缺乏有效的疫苗来预防新孢子虫病,研究新孢子虫的入侵机制和抗原蛋白对新孢子虫病的预防和诊断有参考价值。酵母双杂交技术是目前广泛应用研究一种已知蛋白与另一种已知或未知蛋白之间的相互作用情况,具有简洁性和高敏感性。构建诱饵载体是本试验的重要步骤,首先构建pGBKT7-NcGRA7载体,为进一步研究与NcGRA7基因互作的蛋白奠定基础。本试验通过PCR方法扩增NcGRA7基因,回收的NcGRA7基因先与pMD19T Simple载体连接,转化到DH5α中,进行PCR鉴定和酶切鉴定,以获得含有EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ两种限制性内切酶酶切位点的正确的NcGRA7基因。将pGBKT7载体用EcoRⅠ和Sal Ⅰ两种限制性内切酶酶切,获得两端分别含有这两种酶切位点的pGBKT7载体。并将含有相同酶切位点的NcGRA7基因和pGBKT7载体进行连接,转化到DH5α中,筛选出PCR鉴定和酶切鉴定均正确的pGBKT7-NcGRA7重组质粒,进行测序,与GenBank上的NcGRA7基因序列有100%的同源性。本试验成功地构建了 pGBKT7-NcGRA7诱饵载体,为下一步NcGRA7相互作用蛋白的初步筛选奠定基础。为了保证后续筛选实验中能获得理想的结果,首先要对之前构建的诱饵载体pGBKT7-NcGRA7进行自转录活性和细胞毒性检测。鉴定结果显示构建的诱饵载体pGBKT7-NcGRA7无自转录活性,无细胞毒性。将诱饵载体pGBKT7-NcGRA7与Vero细胞cDNA文库进行杂交筛选,获得234个蓝斑克隆,经PCR鉴定,质粒提取,转化测序等操作后,获得4个阳性质粒,分别为18S核糖体RNA,70kDa热休克蛋白8,NADH脱氢酶亚基1(线粒体),低聚糖转移酶复合物。
【学位单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q78;S852.7
【部分图文】：

３．２?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的ＰＣＲ鉴定与酶切鉴定??ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的连接产物转入大肠杆菌感受态中，克隆培养，菌落ＰＣＲ??鉴定，目的基因片５７０ｂｐ，如图２所示。??１?２?３?４?Ｍ??＿??“‘福麵??图２?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的ＰＣＲ鉴定结果??Ｍ：?ＤＬ５?０００Ｍａｒｋｅｒ；?１、２、３：?ＮｃＧＲＡ７?扩增产物：４：空白对照??Ｆｉｇ．２?Ｔｈｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７?ｂｙ?ＰＣＲ??Ｍ：?ＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?Ｋ?２＞?３：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＮｃＧＲＡ７?ｇｅｎｅ；?４：Ｃｏｎｔｒａｓｔ??１５??

结果??３．１?ＮｃＧＲＡ７基因的扩增??ＮｃＧＲＡ７扩增结果与预期片段大小一致，５７０ｂｐ，如图１。??１?２?Ｍ??ｗ：．．．?…?????７５０ｂｐ??５７０ｂｐ?—＇?Ｈ：?＾—?５００ｂｐ??ｇｇｊｍ??图１?ＮｃＧＲＡ７基因矿增结果??Ｍ：?ＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ＮｃＧＲＡ７?扩增产物；２：空白对照??Ｆｉｇ．?１?Ｔｈｅ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆＮｃＧＲＡ７?ｇｅｎｅ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｍ：?ＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?１?：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＮｃＧＲＡ７?ｇｅｎｅ；?２：Ｃｏｎｔｒａｓｔ??３．２?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的ＰＣＲ鉴定与酶切鉴定??ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的连接产物转入大肠杆菌感受态中，克隆培养，菌落ＰＣＲ??鉴定，目的基因片５７０ｂｐ，如图２所示。??１?２?３?４?Ｍ??＿??“‘福麵??图２?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７的ＰＣＲ鉴定结果??Ｍ：?ＤＬ５?０００Ｍａｒｋｅｒ；?１、２、３：?ＮｃＧＲＡ７?扩增产物：４：空白对照??Ｆｉｇ．２?Ｔｈｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７?ｂｙ?ＰＣＲ??Ｍ：?ＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?Ｋ?２＞?３：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＮｃＧＲＡ７?ｇｅｎｅ；

图３?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７双酶切鉴定??Ｍ：?ＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?ｈ?ＮｃＧＲＡ７；?２：空白对照??ｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＭＤ１９Ｔ－ＮｃＧＲＡ７?ｂｙ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ?ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ?ｄｉｇＤＬ５?０００?Ｍａｒｋｅｒ；?１?：?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＮｃＧＲＡ７?ｇｅｎｅ；?２：Ｃｏｎｔ析??后，结果显示序列与ＮＣＢＩ中ＮｃＧＲＡ７序列同源列如图４所不。??１０?２０?３０?４０?ＳＯ?６Ｄ??Ａ＇ＧＡＡＴＴ?ＯＧ?ＡＧＡ?ＴＴＧＯＣＡ?Ａ?ＧＡＡ：ＡＧ：?ＡＴＧＡＡＧＧＧＧＡ?．．?ＡＴ?ＧＧＡ．ＴＡＴ?ＧＧＧＧＴＴＡＧＧＧ??７０?８０?９０?１００?１１０?１２０??ＡＴＡＴＧ＇＾ＧＧ?：ＧＴＴＴ?ＡＪｌＡＣ?ＴＡＴＧＡ?：ＧＧｖ?Ｇ?ｋＴＧｋ＇ＯｋＴＯ：．?ＴＧＣ．ＡＧＧＡＡＡ?ＴＧＴ．ＧｆＴ??１３０?１４０?１５０?１６０?１７０?１８０??ＣＧＧＡＴＧＴＧＡ?．?ＴＧＡＣＧＡＴＧＣＣ?ＡＴＴＡ?夂ＧＡＴＧ?ＧＴＧＡＧＴＧＧＣＣ?Ａ?Ｃ’ＴＧＴＴＧＴＡ?Ｔ：ＧＧＧＧｆＡＧＡ??１９０?２００?２１０?２２０?２３０?２４０??ＡＧＣｖＧＣＡ?Ａ＇?ＧＡＣＴ?ＡＧＡＡＡ?ＧＧ＇ｌＡＧ?ＴＴＧＡ?Ｔ?．＾ＧＡＡＧ＾Ｔ?ＧＧ?ＡＧＴＡ?Ｇ?ＧＴＧＧＴＣＧＧＣＧ??２５０?２６０?２７０?２８０?２ＳＯ?３００??＂ＴＣＴＴＡＣＧＴ．－?ＧＴＡＴ?ＴＴＧＴＴ?Ｇ?ＴＧＡ－ＡＧＧＧ?ＴＧ?ＴＧ?ＧＡ?ＧＴＴＧＡ；ＴＴ?Ｔ?Ｇ?：?ＡＧＡＡＧＡＡ０??３１０?３２０?３３０?３４０?３Ｓ０?３?６０??－－
【参考文献】

相关博士学位论文 前3条

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相关硕士学位论文 前3条

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本文编号：2892915