内质网分子伴侣Calnexin/Calreticulin辅助埃博拉病毒囊膜糖蛋白成熟机制的研究
发布时间：2020-12-09 09:22
埃博拉出血热（Ebola Hemorrhagic Fever,EHF）是由埃博拉病毒引起的能够感染人类及其他灵长类动物的高度接触性传染病,其主要症状为高热、出血,死亡率高达90%。埃博拉病毒（Ebola virus,EBOV）属于丝状病毒科丝状病毒属的成员,为单股、负链、有囊膜的RNA病毒。其表面的囊膜糖蛋白GP是高度糖基化的蛋白,在介导病毒侵入宿主细胞、诱导机体产生免疫反应等过程中起着关键性作用。分子伴侣钙连蛋白（CNX）、钙网蛋白（CRT）是存在于内质网中的一类分子,能够介导糖蛋白的加工和成熟过程。为了研究内质网分子伴侣CNX、CRT辅助埃博拉病毒囊膜糖蛋白成熟的机制,本试验首先利用CRISPR/Cas9技术构建了CNX、CRT基因敲除的293T细胞系。将表达埃博拉病毒囊膜蛋白GP mucin区域缺失基因（GP△MLD）的重组质粒,与囊膜蛋白缺失、表达荧光素酶（Luc）的人免疫缺陷病病毒I型（HIV-1）基因组的重组质粒共转染人胚胎肾细胞（293T）,以包装整合含有埃博拉病毒囊膜蛋白的伪型EBOV病毒。在293T野生型（WT）、CNX KO、CRT KO、CNX/CRT D.KO的...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 埃博拉病毒概述
1.1.1 埃博拉出血热的流行病学
1.1.2 埃博拉病毒的分类和形态结构
1.1.3 埃博拉病毒的基因组结构及功能
1.2 CNX、CRT蛋白的结构和功能
1.2.1 CNX、CRT的结构和结合位点
1.2.2 CNX、CRT的功能研究
1.2.3 CNX、CRT与病毒相互作用的研究进展
1.3 CRISPR/Cas9技术
1.4 本研究的目的和意义
第二章 利用CRISPR/Cas9技术构建CNX/CRT D.KO的细胞系
2.1 材料和方法
2.1.1 细胞和质粒
2.1.2 主要试剂和抗体
2.1.3 主要的仪器设备
2.1.4 细胞培养基
2.1.5 蛋白免疫印迹（Western blot）所用试剂及溶液
2.1.6 Western blot检测
2.1.7 CNX gRNA引物的设计和质粒的构建
2.1.8 CNX基因敲除单克隆细胞株的筛选及序列分析
2.2 结果与分析
2.2.1 CNX基因敲除gRNA的构建
2.2.2 CNX gRNA转染 48 h后的荧光检测
2.2.3 CNX基因缺失后在CRT KO细胞中的表达
2.2.4 CNX基因缺失后基因测序
2.3 讨论
第三章 CNX、CRT对GP蛋白成熟机制的研究
3.1 材料和方法
3.1.1 细胞和质粒
3.1.2 主要试剂和抗体
3.1.3 主要的仪器设备
3.1.4 细胞培养基
3.1.5 GP蛋白在CNX、CRT敲除细胞系中的蛋白表达和伪病毒组装
3.1.6 CNX、CRT过表达对埃博拉病毒囊膜糖蛋白表达的影响
3.1.7 内源性CNX与GP之间的相互作用研究
3.1.8 外源性CRT与GP之间的相互作用研究
3.1.9 EBOV GP编码基因糖基化位点的突变
3.1.10 含糖基化位点突变的GP基因在细胞内表达和重组假病毒的包装
3.1.11 含糖基化位点突变的GP基因包装假病毒的感染力比较分析
3.1.12 外源性CNX与糖链组合缺失GP蛋白相互作用的研究
3.1.13 内源性CRT与糖链缺失GP蛋白相互作用的研究
3.1.14 Endo H酶对GP糖链组合缺失突变体的消化差异分析
3.1.15 CNX、CRT蛋白对EBOV全长GP蛋白表达及病毒组装能力的影响
3.2 结果与分析
3.2.1 CNX、CRT蛋白缺失抑制了EBOV GP蛋白表达和伪病毒组装
3.2.2 CNX、CRT过表达对埃博拉病毒囊膜糖蛋白表达的影响
3.2.3 内源性CNX与GP之间存在相互作用
3.2.4 外源性CRT与GP之间存在相互作用
3.2.5 EBOV GP编码基因糖基化位点的突变
3.2.6 GP蛋白单点糖链缺失对细胞内蛋白表达和病毒组装的影响
3.2.7 GP蛋白N-端糖链依次缺失对细胞内蛋白表达和病毒组装的影响
3.2.8 GP蛋白糖链组合缺失后对细胞内蛋白表达和病毒组装的影响
3.2.9 GP蛋白糖链组合缺失包装伪病毒的感染差异
3.2.10 外源性CNX与糖链组合缺失GP蛋白相互作用的研究
3.2.11 内源性CRT与糖链组合缺失GP蛋白相互作用的研究
3.2.12 Endo H酶对GP糖链组合缺失突变体的消化差异分析
3.2.13 CNX、CRT蛋白对EBOV全长GP蛋白表达及病毒组装能力的影响
3.3 讨论
第四章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：2906663
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 埃博拉病毒概述
1.1.1 埃博拉出血热的流行病学
1.1.2 埃博拉病毒的分类和形态结构
1.1.3 埃博拉病毒的基因组结构及功能
1.2 CNX、CRT蛋白的结构和功能
1.2.1 CNX、CRT的结构和结合位点
1.2.2 CNX、CRT的功能研究
1.2.3 CNX、CRT与病毒相互作用的研究进展
1.3 CRISPR/Cas9技术
1.4 本研究的目的和意义
第二章 利用CRISPR/Cas9技术构建CNX/CRT D.KO的细胞系
2.1 材料和方法
2.1.1 细胞和质粒
2.1.2 主要试剂和抗体
2.1.3 主要的仪器设备
2.1.4 细胞培养基
2.1.5 蛋白免疫印迹（Western blot）所用试剂及溶液
2.1.6 Western blot检测
2.1.7 CNX gRNA引物的设计和质粒的构建
2.1.8 CNX基因敲除单克隆细胞株的筛选及序列分析
2.2 结果与分析
2.2.1 CNX基因敲除gRNA的构建
2.2.2 CNX gRNA转染 48 h后的荧光检测
2.2.3 CNX基因缺失后在CRT KO细胞中的表达
2.2.4 CNX基因缺失后基因测序
2.3 讨论
第三章 CNX、CRT对GP蛋白成熟机制的研究
3.1 材料和方法
3.1.1 细胞和质粒
3.1.2 主要试剂和抗体
3.1.3 主要的仪器设备
3.1.4 细胞培养基
3.1.5 GP蛋白在CNX、CRT敲除细胞系中的蛋白表达和伪病毒组装
3.1.6 CNX、CRT过表达对埃博拉病毒囊膜糖蛋白表达的影响
3.1.7 内源性CNX与GP之间的相互作用研究
3.1.8 外源性CRT与GP之间的相互作用研究
3.1.9 EBOV GP编码基因糖基化位点的突变
3.1.10 含糖基化位点突变的GP基因在细胞内表达和重组假病毒的包装
3.1.11 含糖基化位点突变的GP基因包装假病毒的感染力比较分析
3.1.12 外源性CNX与糖链组合缺失GP蛋白相互作用的研究
3.1.13 内源性CRT与糖链缺失GP蛋白相互作用的研究
3.1.14 Endo H酶对GP糖链组合缺失突变体的消化差异分析
3.1.15 CNX、CRT蛋白对EBOV全长GP蛋白表达及病毒组装能力的影响
3.2 结果与分析
3.2.1 CNX、CRT蛋白缺失抑制了EBOV GP蛋白表达和伪病毒组装
3.2.2 CNX、CRT过表达对埃博拉病毒囊膜糖蛋白表达的影响
3.2.3 内源性CNX与GP之间存在相互作用
3.2.4 外源性CRT与GP之间存在相互作用
3.2.5 EBOV GP编码基因糖基化位点的突变
3.2.6 GP蛋白单点糖链缺失对细胞内蛋白表达和病毒组装的影响
3.2.7 GP蛋白N-端糖链依次缺失对细胞内蛋白表达和病毒组装的影响
3.2.8 GP蛋白糖链组合缺失后对细胞内蛋白表达和病毒组装的影响
3.2.9 GP蛋白糖链组合缺失包装伪病毒的感染差异
3.2.10 外源性CNX与糖链组合缺失GP蛋白相互作用的研究
3.2.11 内源性CRT与糖链组合缺失GP蛋白相互作用的研究
3.2.12 Endo H酶对GP糖链组合缺失突变体的消化差异分析
3.2.13 CNX、CRT蛋白对EBOV全长GP蛋白表达及病毒组装能力的影响
3.3 讨论
第四章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：2906663
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