马尔堡病毒和埃博拉病毒二价VSV载体疫苗研究
发布时间：2020-12-15 03:41
马尔堡病毒和埃博拉病毒属于丝状病毒属,丝状病毒科,为单股负链非节段RNA病毒,基因组约19kb。该病毒能引起人和非人灵长类动物极其严重的马尔堡出血热或埃博拉出血热,主要症状为多脏器衰竭、天然孔出血、呕血等,死亡率50～90%。由于马尔堡及埃博拉病毒爆发区域重叠,症状相似,为防控该两种病毒感染,我们开展同时针对两种病毒的疫苗研究。马尔堡病毒及埃博拉病毒的表面囊膜糖蛋白为疫苗开发的最主要抗原,而水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）作为疫苗载体,则具有免疫剂量低、安全高效、无预存免疫等优点。因此我们选择安哥拉型马尔堡病毒（Angola Marburg virus glycoprotein,MGP）和扎伊尔型埃博拉（Zaire Ebola virus glycoprotein,ZGP）及其前期筛选的高免疫原性片段GP2A及L,构建二价重组VSV载体疫苗。免疫Balb/c小鼠,测定小鼠血清抗体及淋巴细胞因子等评价潜在的免疫保护作用。1,成功构建6种VSV重组质粒和拯救3种VSV重组病毒。将MGP、GP2Δ、ZGP和L通过不同组合,克隆至VSVΔG载体,替...
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－１载体构建示意图??２．１材料??
２．３．２病毒拯救结果??骨架质粒和辅助质粒按比例与转染试剂混合后加入细胞中拯救病毒，经盲传，细胞产??生病变：不黏连，变圆，皱缩（图２－４），与正常细胞之间形成鲜明对比，说明有病毒的产??生，将重组病毒分别命名为?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ、ｒＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ?和?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ。??■■??．參囊論ｕ：，：丄＇??图２－４病毒包装盲传后细胞形态对照??注：图Ａ阴性对照ＢＨＫ２１ＷＩ２细胞；图ＢｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ盲传于ＢＨＫ２１ＷＩ２细胞；图Ｃ??ｒＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ?盲传于?ＢＨＫ?２１?Ｗ１２?细胞；图?Ｄ?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ?盲传于?ＢＨＫ?２１?ＷＩ２?细胞。??２．３．３病毒ＲＴ－ＰＣＲ的鉴定??病毒?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ、ｒＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ?和?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ?感染细胞后收集上清??提取ＲＮＡ，经ＤＮＡ酶Ｉ消化，反转录为ｃＤＮＡ后，使用反转录引物（ＭＺ?ｍｉｄｄｌｅ?Ｆ，ＭＺ?ｍｉｄｄｌｅ??Ｒ）、（ＧＰ２Ａ－ＬＦ，?ＧＰ２Ａ－ＬＲ）和（ＭＧＰ－ＬＦ，?ＭＧＰ－ＬＲ）分别扩增以上病毒的插入基因；??使用反转录引物（ＶＳＶ－ＭＦ，?ＶＳＶ－ＭＲ）扩增以上病毒中ＶＳＶ骨架的Ｍ基因。??核酸琼脂糖凝胶电泳（图２－５）结果表明，病毒ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ基因组中含有ＭＧＰ??和ＺＧＰ序歹ｉｊ，ｒＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ基因组中含有ＧＰ２Ａ—Ｌ序列，ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ基因组中含??有ＭＧＰ－Ｌ序列
ＭＯＩ＝０．０１的病毒液感染细胞后，每１２ｈ取细胞上清，根据各个时间点病毒的ＴＣＩＤ５０??绘制柄毒体外生长曲线，可以看出病毒感染后４８ｈ－６０ｈ滴度最闻。病毒整个增殖的过程也??符合实际病毒先增后减的趋势（图２－８）。??ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ??ｇ３－??５１＿?嚷??〇?Ｉ?＼?Ｖ?１?１?＼?Ｔ?Ｉ?１??０?１２?２４?３６?４８?￡０?７２?２４?０６??Ｔｉｍｅ?（ｈ）??图２－８?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ重组病毒体外生长曲线??２．４讨论与小结??前期构建质粒时，连接插入基因之间的是口蹄疫病毒基因组的２Ａ序列，得到质粒??ｐＶＳＶＡＧ－ＭＧＰＲ－２Ａ－Ｌ、ｐＶＳＶＡＧ－ＭＧＰＭ－２Ａ－Ｌ?和?ｐＶＳＶＡＧ－ＺＧＰ－２Ａ－Ｌ，该?２Ａ?序列在翻译??为蛋白后，具有自裂解功能，能将其前后连接的蛋白一分为二，但裂解不充分或者其中一??种蛋白表达量明显过低是其重要缺点［１８８，１８９］。此三种质粒未拯救出病毒。后经过多次查阅??文献和大量实验摸索，将插入基因之间的连接序列改为ＶＳＶ基因间的保守序列一转录终??止起始序列，据报道，此序列能提高ＶＳＶ重组病毒拯救效率及稳定性１｜８７１。故构建新的重??组质粒?ｐＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ、ｐＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ?和?ＰＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ，并在相同的病毒拯救??
【参考文献】：
期刊论文
[1]高等级生物安全实验室在生物安全领域的作用及其发展的思考[J]. 刘静,李超,柳金雄,何蕊,孙燕荣. 中国农业科学. 2020(01)
[2]Tim-1抗体在防治埃博拉及马尔堡病毒感染中的作用研究[J]. 张艳玲,李淑莲,李葛,窦帅杰,刘艺琼,张嘉诚,李国贤,侯春梅,冯健男,沈倍奋,韩根成. 军事医学. 2018(12)
本文编号：2917587
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２－１载体构建示意图??２．１材料??
２．３．２病毒拯救结果??骨架质粒和辅助质粒按比例与转染试剂混合后加入细胞中拯救病毒，经盲传，细胞产??生病变：不黏连，变圆，皱缩（图２－４），与正常细胞之间形成鲜明对比，说明有病毒的产??生，将重组病毒分别命名为?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ、ｒＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ?和?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ。??■■??．參囊論ｕ：，：丄＇??图２－４病毒包装盲传后细胞形态对照??注：图Ａ阴性对照ＢＨＫ２１ＷＩ２细胞；图ＢｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ盲传于ＢＨＫ２１ＷＩ２细胞；图Ｃ??ｒＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ?盲传于?ＢＨＫ?２１?Ｗ１２?细胞；图?Ｄ?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ?盲传于?ＢＨＫ?２１?ＷＩ２?细胞。??２．３．３病毒ＲＴ－ＰＣＲ的鉴定??病毒?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ、ｒＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ?和?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ?感染细胞后收集上清??提取ＲＮＡ，经ＤＮＡ酶Ｉ消化，反转录为ｃＤＮＡ后，使用反转录引物（ＭＺ?ｍｉｄｄｌｅ?Ｆ，ＭＺ?ｍｉｄｄｌｅ??Ｒ）、（ＧＰ２Ａ－ＬＦ，?ＧＰ２Ａ－ＬＲ）和（ＭＧＰ－ＬＦ，?ＭＧＰ－ＬＲ）分别扩增以上病毒的插入基因；??使用反转录引物（ＶＳＶ－ＭＦ，?ＶＳＶ－ＭＲ）扩增以上病毒中ＶＳＶ骨架的Ｍ基因。??核酸琼脂糖凝胶电泳（图２－５）结果表明，病毒ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ基因组中含有ＭＧＰ??和ＺＧＰ序歹ｉｊ，ｒＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ基因组中含有ＧＰ２Ａ—Ｌ序列，ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ基因组中含??有ＭＧＰ－Ｌ序列
ＭＯＩ＝０．０１的病毒液感染细胞后，每１２ｈ取细胞上清，根据各个时间点病毒的ＴＣＩＤ５０??绘制柄毒体外生长曲线，可以看出病毒感染后４８ｈ－６０ｈ滴度最闻。病毒整个增殖的过程也??符合实际病毒先增后减的趋势（图２－８）。??ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ??ｇ３－??５１＿?嚷??〇?Ｉ?＼?Ｖ?１?１?＼?Ｔ?Ｉ?１??０?１２?２４?３６?４８?￡０?７２?２４?０６??Ｔｉｍｅ?（ｈ）??图２－８?ｒＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ重组病毒体外生长曲线??２．４讨论与小结??前期构建质粒时，连接插入基因之间的是口蹄疫病毒基因组的２Ａ序列，得到质粒??ｐＶＳＶＡＧ－ＭＧＰＲ－２Ａ－Ｌ、ｐＶＳＶＡＧ－ＭＧＰＭ－２Ａ－Ｌ?和?ｐＶＳＶＡＧ－ＺＧＰ－２Ａ－Ｌ，该?２Ａ?序列在翻译??为蛋白后，具有自裂解功能，能将其前后连接的蛋白一分为二，但裂解不充分或者其中一??种蛋白表达量明显过低是其重要缺点［１８８，１８９］。此三种质粒未拯救出病毒。后经过多次查阅??文献和大量实验摸索，将插入基因之间的连接序列改为ＶＳＶ基因间的保守序列一转录终??止起始序列，据报道，此序列能提高ＶＳＶ重组病毒拯救效率及稳定性１｜８７１。故构建新的重??组质粒?ｐＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－ＺＧＰ、ｐＶＳＶＡＧ－ＭＧＰ－Ｌ?和?ＰＶＳＶＡＧ－ＧＰ２Ａ－Ｌ，并在相同的病毒拯救??
【参考文献】：
期刊论文
[1]高等级生物安全实验室在生物安全领域的作用及其发展的思考[J]. 刘静,李超,柳金雄,何蕊,孙燕荣. 中国农业科学. 2020(01)
[2]Tim-1抗体在防治埃博拉及马尔堡病毒感染中的作用研究[J]. 张艳玲,李淑莲,李葛,窦帅杰,刘艺琼,张嘉诚,李国贤,侯春梅,冯健男,沈倍奋,韩根成. 军事医学. 2018(12)
本文编号：2917587
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