LncRNA LRRC75A-AS1对奶牛乳腺上皮细胞的生物学特性及功能的影响
发布时间：2020-12-24 00:42
奶牛乳腺炎是奶牛养殖业最常见的疾病之一,临床上常有较高的发病率。当环境中的致病菌侵入奶牛乳腺突破乳腺上皮紧密连接形成的物理屏障后,在乳腺内急剧繁殖扩增,导致血乳屏障破坏进而引发奶牛乳腺的炎症反应。近年来的研究发现,长链非编码RNA（long non coding RNA,lncRNA）在多种炎症过程中发挥着关键的调控作用,但其是否参与奶牛乳腺的炎症反应过程鲜有报道。实验室前期通过高通量测序发现一个lncRNA,该lncRNA在大肠杆菌处理的奶牛乳腺上皮细胞中显著下调。因在染色体上位于其相邻的编码蛋白基因富亮氨酸重复序列75A蛋白（leucine-rich repeat-containing protein 75A,LRRC75A）的反义链,且部分与LRRC75A基因互补,故将这条LncRNA命名为LRRC75A反义链lncRNA1（LRRC75A-AS1）。本研究通过CRISPR/Cas9系统敲除LRRC75A-AS1在奶牛乳腺上皮细胞中的降低,通过一系列分子生学方法和手段研究其在奶牛乳腺上皮细中的作用及机制。实验取得如下结果:1.在炎症状态下,LRRC75A-AS1在奶牛乳腺组织和乳...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
第一章 文献综述
1.1 奶牛乳腺炎的研究进展
1.1.1 奶牛乳腺炎概况
1.1.2 奶牛乳腺炎的细胞免疫机制
1.1.3 奶牛乳腺炎的预防与治疗
1.2 LncRNA的研究现状
1.2.1 LncRNA概述
1.2.2 LncRNA在疾病中的研究进展
1.2.3 LncRNA与炎症通路
1.3 紧密连接研究进展
1.3.1 紧密连接概述
1.3.2 紧密连接蛋白
第二章 LncRNA LRRC75A-AS1 对奶牛乳腺上皮细胞的生物学特性及功能的影响
2.1 材料
2.1.1 乳腺组织和细胞
2.1.2 仪器设备
2.1.3 试剂
2.2 方法
2.2.1 主要溶液的配制
2.2.2 乳腺上皮细胞的复苏
2.2.3 乳腺上皮细胞的传代培养
2.2.4 乳腺上皮细胞的冻存
2.2.5 细菌的灭活与使用
2.2.6 乳腺组织和细胞RNA提取
2.2.7 实时荧光定量PCR
2.2.8 酶联免疫吸附实验
2.2.9 蛋白和RNA核质分离实验
2.2.10 电转染siRNA干扰片段
2.2.11 cDNA末端快速克隆RACE
2.2.12 CRISPR-Cas9 质粒以及过表达质粒的构建
2.2.13 免疫荧光
2.2.14 细胞增殖实验
2.2.15 彗星实验
2.2.16 细菌黏附和侵袭实验
2.2.17 细胞膜通透性实验
2.2.18 双荧光素酶报告实验
2.2.19 蛋白印迹实验
2.2.20 统计分析
2.3 结果
2.3.1 LRRC75A-AS1 在乳腺组织和上皮细胞中的表达水平
2.3.2 稳定敲除LRRC75A-AS1 的乳腺上皮细胞系的建立
2.3.3 稳定敲除LRRC75A-AS1对MAC-T细胞形态的影响
2.3.4 敲除LRRC75A-AS1 促进MAC-T细胞β-酪蛋白的分泌
2.3.5 敲除LRRC75A-AS1 对细胞增殖和DNA损伤的影响
2.3.6 LRRC75A-AS1 的敲除增强紧密连接蛋白的表达
2.3.7 LRRC75A-AS1 敲除降低细胞膜通透性并抑制细菌黏附和侵袭
2.3.8 敲除LRRC75A-AS1 抑制炎性应答
2.3.9 LRRC75A-AS1 正调控LRRC75A的表达
2.3.10 LRRC75A负调控紧密连接蛋白的表达
2.3.11 LRRC75A影响细胞通透性以及细菌的黏附和侵袭
2.3.12 LRRC75A影响NF-κB通路的激活
2.4 讨论
全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简介
本文编号：2934646
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
第一章 文献综述
1.1 奶牛乳腺炎的研究进展
1.1.1 奶牛乳腺炎概况
1.1.2 奶牛乳腺炎的细胞免疫机制
1.1.3 奶牛乳腺炎的预防与治疗
1.2 LncRNA的研究现状
1.2.1 LncRNA概述
1.2.2 LncRNA在疾病中的研究进展
1.2.3 LncRNA与炎症通路
1.3 紧密连接研究进展
1.3.1 紧密连接概述
1.3.2 紧密连接蛋白
第二章 LncRNA LRRC75A-AS1 对奶牛乳腺上皮细胞的生物学特性及功能的影响
2.1 材料
2.1.1 乳腺组织和细胞
2.1.2 仪器设备
2.1.3 试剂
2.2 方法
2.2.1 主要溶液的配制
2.2.2 乳腺上皮细胞的复苏
2.2.3 乳腺上皮细胞的传代培养
2.2.4 乳腺上皮细胞的冻存
2.2.5 细菌的灭活与使用
2.2.6 乳腺组织和细胞RNA提取
2.2.7 实时荧光定量PCR
2.2.8 酶联免疫吸附实验
2.2.9 蛋白和RNA核质分离实验
2.2.10 电转染siRNA干扰片段
2.2.11 cDNA末端快速克隆RACE
2.2.12 CRISPR-Cas9 质粒以及过表达质粒的构建
2.2.13 免疫荧光
2.2.14 细胞增殖实验
2.2.15 彗星实验
2.2.16 细菌黏附和侵袭实验
2.2.17 细胞膜通透性实验
2.2.18 双荧光素酶报告实验
2.2.19 蛋白印迹实验
2.2.20 统计分析
2.3 结果
2.3.1 LRRC75A-AS1 在乳腺组织和上皮细胞中的表达水平
2.3.2 稳定敲除LRRC75A-AS1 的乳腺上皮细胞系的建立
2.3.3 稳定敲除LRRC75A-AS1对MAC-T细胞形态的影响
2.3.4 敲除LRRC75A-AS1 促进MAC-T细胞β-酪蛋白的分泌
2.3.5 敲除LRRC75A-AS1 对细胞增殖和DNA损伤的影响
2.3.6 LRRC75A-AS1 的敲除增强紧密连接蛋白的表达
2.3.7 LRRC75A-AS1 敲除降低细胞膜通透性并抑制细菌黏附和侵袭
2.3.8 敲除LRRC75A-AS1 抑制炎性应答
2.3.9 LRRC75A-AS1 正调控LRRC75A的表达
2.3.10 LRRC75A负调控紧密连接蛋白的表达
2.3.11 LRRC75A影响细胞通透性以及细菌的黏附和侵袭
2.3.12 LRRC75A影响NF-κB通路的激活
2.4 讨论
全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简介
本文编号：2934646
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