慢病毒载体纳米抗体库构建及抗PEDV基因筛选

发布时间：2020-12-28 18:40

　　猪流行性腹泻病（PED）是由病原体猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染引起的严重危害养猪业发展的肠道疾病,导致感染猪脱水、腹泻和呕吐,尤其对哺乳期的仔猪危害最大,发病率和死亡率极高,严重制约全球养猪业的发展。但到目前为止,针对PEDV全球性暴发尚无有效的应对措施,仅仅依靠缓解症状的药物和疫苗来预防和控制,效果并不理想。因此,寻找出有效的抗PEDV药物成了预防和控制PEDV的关键步骤。以往研究表明,PEDV既可以在加有胰酶的猴肾细胞（Vero）系中高效繁殖,也可以在宿主靶细胞猪小肠上皮细胞（IEC）中繁殖,且均能产生明显的细胞病变（CytopathicEffect,CPE）,因此,Vero细胞与IEC细胞可作为筛选具有抗PEDV的目的基因的理想细胞系。本研究旨在利用慢病毒等相关技术构建外周血单核细胞（PBMC）的免疫纳米抗体库,来寻找具有抗PEDV作用的基因。通过SMART技术获得的VHHs文库连接到慢病毒表达载体上,将包装质粒与慢病毒其他三个辅助质粒共同转染293T细胞,从而获得具有感染性的慢病毒文库,通过此文库感染Vero细胞与IEC细胞,构建稳转细胞系,并用PEDV病毒对此细胞系进行筛... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：77 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

CcdB-Cm基因PCR扩增产物

各有一条清晰条带，与目的条带的大小相符，由此可知，重组质粒 pCD513B-1-Ccdb-Cm构建成功。图1-2. 质粒pCD513B-1经限制性内切酶Xba I和BamH I酶切线性化的结果1：M. DL 15k DNA Marker；2：pCD513B-1原质粒；3：pCD513B-1双酶切；Fig.1-2 pCD513B-1 analyzed by restriction endonucleases Xba I and Bam H I digestion1：M. DL 15k DNA Marker；2：pCD513B-1plasmid; 3：Xba I/BamH I digestion of pCD513B-1图 1-3 致死基因Ccdb-Cm经限制性内切酶Xba I和Bgl II酶切的结果1-2：Ccdb-Cm双酶切结果；3：M. 2Kb plus DNA Marker；Fig.1-3 Ccdb-Cm analyzed by restriction endonucleases Xba I and Bgl II digestion1-2：Xba I/Bam H I digestion of Ccdb-Cm；3：M. 2Kb plus DNA Marker12

期吻合（图 1-4）；将得到的重组质凝胶电泳检测分析，如图 1-5 所示的条带的大小相符，由此可知，重组513B-1经限制性内切酶Xba I和BamH I酶A Marker；2：pCD513B-1原质粒；3：pnalyzed by restriction endonucleases Xba er；2：pCD513B-1plasmid; 3：Xba I/Bam

【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒与宿主抗病毒天然免疫抑制[J]. 郭存财,刘炎,黄耀伟.  中国生物化学与分子生物学报. 2016(09)

博士论文
[1]猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白纳米抗体的筛选及其抗病毒功能研究[D]. 刘红亮.西北农林科技大学 2016
[2]猪圆环病毒2型（PCV2）Cap相互作用蛋白及其纳米抗体的筛选与功能研究[D]. 付向晶.西北农林科技大学 2014

硕士论文
[1]新城疫病毒融合蛋白纳米抗体的筛选与鉴定[D]. 胡湘云.西北农林科技大学 2015
[2]猪IEC酵母cDNA文库的构建及与PEDV结构蛋白互作蛋白的筛选[D]. 徐天.中国农业科学院 2015



本文编号：2944217