CRISPR/Cas9编辑獭兔MSTN基因的研究
发布时间：2021-01-08 06:26
CRISPR/Cas9技术是近年发展起来的基因定点修饰技术,它有制作简单、成本低、作用效果高等特点。精子载体法是生产转基因动物的一种简单有效的方法。本研究探讨将精子携带法和CRISPR/Cas9技术结合,编辑獭兔的MSTN基因。本研究针对獭兔MSTN基因序列挑选2个靶位点,并设计出2对sgRNA,构建出2个MSTN基因编辑载体。然后将MSTN基因敲除载体和精子混合,再经过人工受精方法试图编辑獭兔的MSTN基因。结果显示:2个MSTN基因敲除载体构建成功,载体重要元件没有出现缺失。本试验进行人工授精的母兔32只。共有11只母兔怀孕,其中有3只母兔临产死亡。试验中生产出47只仔兔,其中有10只仔兔因母兔临产死亡导致没有存活,经过检测发现没有得到基因编辑的獭兔。利用精子携带法能将基于CRISPR/Cas9技术编辑獭兔MSTN基因存在不稳定性,本研究为进一步获得MSTN基因编辑獭兔进行了探索,获得了宝贵经验。
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：48 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
獭兔照片
图 2 CRISPR/Cas9 工作机制Fig.2 The Working mechanism of CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9 的分类ISPR/Cas 系统中的 Cas 基因具有编码核酸酶、聚合酶、解旋酶的作用，DNA 入侵起重要作用。根据 Cas 蛋白之间进化保守性及功能等因素 系统分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型[16]。Ⅰ型主要存在于细菌和古细菌；Ⅱ型只[24]；Ⅲ型大部分在古细菌发现，细菌中很少见过。和 III 型较为复杂，都具有 CRISPR/Cas 系统共有的重要特征，都包含特酶（Cas）和 guide RNA，且需要多种蛋白共同作用。其中，Ⅰ型含 6性蛋白是 Cas3 蛋白，其可形成 CRISPR 相关病毒防御复合物 Cascad成核糖核蛋白[25]，从而使 crRNA 与双链 DNA 形成 R 环结构。其中与 c由 Cas3 的核酸酶切开，另外一条由 Cas3 解旋酶和核酸酶切断[26]。Ⅲ白，含有标志性的 RAMP 蛋白，具有 RNA 酶功能，参与 crRNA 的成熟
组水平主要分为三部分：5’端的tracrRNA基因、中间的多种编码Cas蛋白基因（CCas1、Cas2 和 Csn2）、3’端的 CRISPR 基因座（包括启动子区域、多个间隔序列-s及重复序列-repeats）。其中 tracrRNA 位点为反式调控激活 crRNA 位点（trans-actcrRNA，tracrRNA）。前体 crRNA（CRISPR-derived RNA）位点由间隔序列和重列相互间隔形成。Cas9 蛋白进行 crRNA 的加工及对入侵核酸的降解。tracrRNA工后的 crRNA 结合形成 RNA 二聚体，在 Cas9 蛋白的引导下对外源核酸进行特切割。
【参考文献】：
期刊论文
[1]山羊肌生成抑制素（MSTN）基因的克隆及生物信息学分析[J]. 金鑫燕. 中国畜牧兽医. 2011(09)
[2]獭兔毛皮特征及质量评定方法[J]. 高雅琴,杜天庆,席斌,常玉兰,李维红,牛春娥. 中国养兔杂志. 2008(05)
[3]如何选择獭兔品种的标准色型[J]. 袁锡寿. 农村百事通. 2006(16)
[4]用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠[J]. 沈新明,乔贵林,张玲,江培洲,黄华,姚开泰. 第一军医大学学报. 2002(03)
[5]兔肉的食用价值[J]. 薛志勇. 山东食品科技. 2002(03)
[6]兔中之王——獭兔[J]. 余志菊,刘汉中,范成强. 四川畜牧兽医. 2000(08)
[7]脂质体介导外源基因体外转染精子的研究[J]. 黄伟民,赖良学,乔桂林,岳军明,安靓,王凯,付殿国,殷震,李进. 第一军医大学学报. 2000(03)
[8]第一讲 獭兔的品种特征与选种技术[J]. 陶岳荣. 毛皮动物饲养. 1991(02)
[9]獭兔的毛色类型与品种特征[J]. 陶岳荣. 国外畜牧学(草食家畜). 1988(02)
博士论文
[1]不同被毛密度獭兔皮肤组织的差异表达基因筛选和CCNA2基因的多态性检测及其与被毛密度的相关性研究[D]. 陈赛娟.河北农业大学 2011
[2]山羊肌肉生长抑制素基因多态性及其与生产性能相关性研究[D]. 刘铮铸.内蒙古农业大学 2006
硕士论文
[1]用精子载体法制备转基因动物模型的研究[D]. 牟红梅.西北农林科技大学 2002
本文编号：2964096
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：48 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
獭兔照片
图 2 CRISPR/Cas9 工作机制Fig.2 The Working mechanism of CRISPR/Cas9CRISPR/Cas9 的分类ISPR/Cas 系统中的 Cas 基因具有编码核酸酶、聚合酶、解旋酶的作用，DNA 入侵起重要作用。根据 Cas 蛋白之间进化保守性及功能等因素 系统分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型[16]。Ⅰ型主要存在于细菌和古细菌；Ⅱ型只[24]；Ⅲ型大部分在古细菌发现，细菌中很少见过。和 III 型较为复杂，都具有 CRISPR/Cas 系统共有的重要特征，都包含特酶（Cas）和 guide RNA，且需要多种蛋白共同作用。其中，Ⅰ型含 6性蛋白是 Cas3 蛋白，其可形成 CRISPR 相关病毒防御复合物 Cascad成核糖核蛋白[25]，从而使 crRNA 与双链 DNA 形成 R 环结构。其中与 c由 Cas3 的核酸酶切开，另外一条由 Cas3 解旋酶和核酸酶切断[26]。Ⅲ白，含有标志性的 RAMP 蛋白，具有 RNA 酶功能，参与 crRNA 的成熟
组水平主要分为三部分：5’端的tracrRNA基因、中间的多种编码Cas蛋白基因（CCas1、Cas2 和 Csn2）、3’端的 CRISPR 基因座（包括启动子区域、多个间隔序列-s及重复序列-repeats）。其中 tracrRNA 位点为反式调控激活 crRNA 位点（trans-actcrRNA，tracrRNA）。前体 crRNA（CRISPR-derived RNA）位点由间隔序列和重列相互间隔形成。Cas9 蛋白进行 crRNA 的加工及对入侵核酸的降解。tracrRNA工后的 crRNA 结合形成 RNA 二聚体，在 Cas9 蛋白的引导下对外源核酸进行特切割。
【参考文献】：
期刊论文
[1]山羊肌生成抑制素（MSTN）基因的克隆及生物信息学分析[J]. 金鑫燕. 中国畜牧兽医. 2011(09)
[2]獭兔毛皮特征及质量评定方法[J]. 高雅琴,杜天庆,席斌,常玉兰,李维红,牛春娥. 中国养兔杂志. 2008(05)
[3]如何选择獭兔品种的标准色型[J]. 袁锡寿. 农村百事通. 2006(16)
[4]用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠[J]. 沈新明,乔贵林,张玲,江培洲,黄华,姚开泰. 第一军医大学学报. 2002(03)
[5]兔肉的食用价值[J]. 薛志勇. 山东食品科技. 2002(03)
[6]兔中之王——獭兔[J]. 余志菊,刘汉中,范成强. 四川畜牧兽医. 2000(08)
[7]脂质体介导外源基因体外转染精子的研究[J]. 黄伟民,赖良学,乔桂林,岳军明,安靓,王凯,付殿国,殷震,李进. 第一军医大学学报. 2000(03)
[8]第一讲 獭兔的品种特征与选种技术[J]. 陶岳荣. 毛皮动物饲养. 1991(02)
[9]獭兔的毛色类型与品种特征[J]. 陶岳荣. 国外畜牧学(草食家畜). 1988(02)
博士论文
[1]不同被毛密度獭兔皮肤组织的差异表达基因筛选和CCNA2基因的多态性检测及其与被毛密度的相关性研究[D]. 陈赛娟.河北农业大学 2011
[2]山羊肌肉生长抑制素基因多态性及其与生产性能相关性研究[D]. 刘铮铸.内蒙古农业大学 2006
硕士论文
[1]用精子载体法制备转基因动物模型的研究[D]. 牟红梅.西北农林科技大学 2002
本文编号：2964096
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