miR-148a和miR-10a的靶基因验证及在湖羊毛乳头细胞中的功能初步研究
发布时间：2021-01-11 15:25
湖羊是我国著名的多羔绵羊品种兼羔皮用绵羊品种。近年来,由于人们对湖羊肉用性能的重视,以及产区外部分外来品种的引入,导致湖羊羔皮品质逐渐下降。毛囊是由20多种细胞构成的皮肤附属器官,其中毛乳头细胞在毛囊生长发育过程中起着关键作用。microRNAs（miRNAs）是一类长约18-24nt,在转录后水平介导基因沉默的短单链非编码RNA。研究表明,大量miRNAs参与毛囊的发生发育和周期性生长。本研究以湖羊为研究对象,通过机械分离法和酶消化法成功培养了湖羊羔皮毛囊毛乳头细胞,并在课题组前期基因芯片和高通量测序结果的基础上,以在湖羊不同花纹羔皮毛囊中呈现差异表达的BMP7基因为研究线索,利用生物信息学软件预测并筛选出靶向BMP7的miRNAs,并与本课题组前期进行的湖羊不同花纹羔皮毛囊的miRNA测序数据取交集得到miR-148a和miR-10a,通过双荧光素酶报告基因检测、Western Blot和RT-qPCR技术验证其靶向关系,最后利用CCK-8和RT-qPCR检测miR-148a和miR-10a对湖羊毛乳头细胞增殖以及与毛囊相关信号通路（TGF-β/Smads 通路）中部分基因（Sma...
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１毛囊的结构图［１３］??Ｆｉｇ．?１－１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｈａｉｒ?ｆｏｌｌｉｃｌｅ＾１３】??
、官形成、肌肉生长发育、脂肪代谢以及机体的免疫应答等反应１４５］。１９９３年，秀丽隐杆线虫中发现了第一个ｍｉＲＮＡ?（Ｈｎ－４），此后在人、鼠、羊等各种生ｍｉＲＮＡ被相继发现并被鉴定。??ｍｉＲＮＡ同基因一样，由ＤＮＡ转录形成。在细胞核内，首先由ＲＮＡ聚合约几百到数千个核苷酸且具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的初级ｍｉＲＮＡ（ＰｒｉＰｉｒ－ｍｉＲＮＡ），然后在Ｄｒｏｓｈａ酶和辅助因子的作用下，Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ被切割为６ｍｉＲＮＡ?（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ?ｍｉＲＮＡ），接着在?ＲＡＮ－ＧＴＰ?和输出蛋白?５?ＣＥｘｐｏｒｔｉｎ?５）ｍｉＲＮＡ被转运到细胞质中，再由Ｄｉｃｅｒ内切酶被加工成约２２?ｎｔ的不完善的（ｍｉＲＮＡ：?ｍｉＲＮＡｄｕｐｌｅｘ）。随后，ｍｉＲＮＡ?经解链形成成熟?ｍｉＲＮＡ?（ｍａｔｕｒｅｍｍｉＲＮＡ再与ＲＮＡ诱导的沉默复合体（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ?ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ?ｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ与ｍｉＲＮＡ靶基因位点互补，从而能发挥其生物学效应。ｍｉＲＮＡ与靶基因有两一种是完全互补，则会造成ＲＩＳＣ破坏ｍＲＮＡ脱腺苷酸化后去帽，从而引［４７１；另一种为不完全互补，尤其是ｍｉＲＮＡ的５’端的第２－８个碱基与ｍＲＮＡ结不会被ＲＩＳＣ降解，而是通过阻碍ｍＲＮＡ的转录来抑制其翻译１４８〗。??
乳头细胞的分离培养??离心法结合中性蛋白酶和ＩＶ型胶原酶消化法分离的湖羊毛乳头观察呈圆形或椭圆形。细胞分离培养的第２天可见细胞贴壁（％细胞贴壁，细胞增殖速度明显加快，外观呈长三角形或多角形，（图２－１?Ｂ）。毛乳头细胞生长至６天以后呈放射状向四周生长，的形状，并形成致密区（图２－１?Ｃ）。１２天细胞已逐渐融合成细呈放射状向外生长，中央区细胞出现多层化向上堆积，呈现出?Ｄ），当湖羊毛乳头细胞传至２０代时仍保留这种凝集性生长的乳头细胞培养至１５天可进行首次传代，随着细胞传代次数的增逐渐缩小。待湖羊毛乳头细胞生长趋于稳定后，培养３－４天的８０－９０％并可进行传代。与此同时，随着传代次数的增加，毛乳类似成纤维细胞，但胞体比成纤维细胞体胞大，且呈漩涡状生Ａ?Ｂ??
【参考文献】：
期刊论文
[1]藏绵羊不同毛色皮肤组织miRNA表达谱及靶基因分析[J]. 吴震洋,唐晓惠,付玉华,王昇,章程,李京津,余梅,杜小勇. 中国农业科学. 2018(02)
[2]羊生产性状相关microRNA的研究进展[J]. 杨灵芝,巩佳昕,刘念,祁琪,王健,沈露露,房兴堂,李勇,李忠昌. 黑龙江畜牧兽医. 2017(21)
[3]长毛兔毛乳头细胞的分离培养及生长特性研究[J]. 白莉雅,孙海涛,呼红梅,杨丽萍,高淑霞,姜文学. 家畜生态学报. 2017(10)
[4]不同品种羊miR-1298-5p及其潜在靶基因TGF-βR1表达的比较研究[J]. 张桂山,徐晶,孙丽敏,白曼,项露杰,姜怀志. 中国农学通报. 2017(27)
[5]microRNA-10a/b通过抑制Mib1调节斑马鱼神经元的发育[J]. 吕峰,石运伟,王新,刘东,严兴洪. 中国细胞生物学学报. 2017(02)
[6]生长因子EGF、aFGF、bFGF对毛乳头细胞生长的研究[J]. 潘霄汝,张汝芝,金慧玲. 齐齐哈尔医学院学报. 2017(02)
[7]BMP7基因在细毛羊皮肤毛囊中的表达及与羊毛性状的关系[J]. 王小佳,贺建宁,程明,刘开东,柳楠. 中国畜牧杂志. 2016(19)
[8]MicroRNA-148b promotes proliferation of hair follicle cells by targeting NFAT5[J]. Wanbao YANG,Qinqun LI,Bo SU,Mei YU. Frontiers of Agricultural Science and Engineering. 2016(01)
[9]毛乳头细胞的研究现状[J]. 苏胤杰,杨劲,张艺,星懿展. 医学综述. 2014(01)
[10]miRNA在调控皮肤和毛囊发育中的作用[J]. 蔡婷,刘志红,王志新,赵濛,俎红丽,李金泉. 遗传. 2013(09)
博士论文
[1]过表达miR-148a对猪体细胞重编程及其核移植胚胎发育影响的初步研究[D]. 王萍.广西大学 2017
[2]内蒙古绒山羊皮肤毛囊毛乳头细胞系的建立及其基因表达谱型的研究[D]. 朱兵.内蒙古大学 2014
[3]骨骼肌发育中miR-148a功能与qPCR内参基因的研究[D]. 张晶.华中农业大学 2012
硕士论文
[1]miR-let7a在辽宁绒山羊毛囊发育周期中的差异表达及其靶基因功能鉴定[D]. 江倩.吉林大学 2015
[2]绵羊MIR-148b和MIR-320对毛囊发育调控研究[D]. 李勤群.华中农业大学 2014
[3]IGF-1、FGF7与毛乳头细胞生物学特性的相关性及复方甘草酸苷、地塞米松对毛乳头细胞活性影响的研究[D]. 程毅.河北医科大学 2010
[4]毛乳头细胞及其部分相关生长因子的研究[D]. 李玲.河北医科大学 2010
本文编号：2971023
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１毛囊的结构图［１３］??Ｆｉｇ．?１－１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｈａｉｒ?ｆｏｌｌｉｃｌｅ＾１３】??
、官形成、肌肉生长发育、脂肪代谢以及机体的免疫应答等反应１４５］。１９９３年，秀丽隐杆线虫中发现了第一个ｍｉＲＮＡ?（Ｈｎ－４），此后在人、鼠、羊等各种生ｍｉＲＮＡ被相继发现并被鉴定。??ｍｉＲＮＡ同基因一样，由ＤＮＡ转录形成。在细胞核内，首先由ＲＮＡ聚合约几百到数千个核苷酸且具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的初级ｍｉＲＮＡ（ＰｒｉＰｉｒ－ｍｉＲＮＡ），然后在Ｄｒｏｓｈａ酶和辅助因子的作用下，Ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ被切割为６ｍｉＲＮＡ?（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ?ｍｉＲＮＡ），接着在?ＲＡＮ－ＧＴＰ?和输出蛋白?５?ＣＥｘｐｏｒｔｉｎ?５）ｍｉＲＮＡ被转运到细胞质中，再由Ｄｉｃｅｒ内切酶被加工成约２２?ｎｔ的不完善的（ｍｉＲＮＡ：?ｍｉＲＮＡｄｕｐｌｅｘ）。随后，ｍｉＲＮＡ?经解链形成成熟?ｍｉＲＮＡ?（ｍａｔｕｒｅｍｍｉＲＮＡ再与ＲＮＡ诱导的沉默复合体（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ?ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ?ｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ与ｍｉＲＮＡ靶基因位点互补，从而能发挥其生物学效应。ｍｉＲＮＡ与靶基因有两一种是完全互补，则会造成ＲＩＳＣ破坏ｍＲＮＡ脱腺苷酸化后去帽，从而引［４７１；另一种为不完全互补，尤其是ｍｉＲＮＡ的５’端的第２－８个碱基与ｍＲＮＡ结不会被ＲＩＳＣ降解，而是通过阻碍ｍＲＮＡ的转录来抑制其翻译１４８〗。??
乳头细胞的分离培养??离心法结合中性蛋白酶和ＩＶ型胶原酶消化法分离的湖羊毛乳头观察呈圆形或椭圆形。细胞分离培养的第２天可见细胞贴壁（％细胞贴壁，细胞增殖速度明显加快，外观呈长三角形或多角形，（图２－１?Ｂ）。毛乳头细胞生长至６天以后呈放射状向四周生长，的形状，并形成致密区（图２－１?Ｃ）。１２天细胞已逐渐融合成细呈放射状向外生长，中央区细胞出现多层化向上堆积，呈现出?Ｄ），当湖羊毛乳头细胞传至２０代时仍保留这种凝集性生长的乳头细胞培养至１５天可进行首次传代，随着细胞传代次数的增逐渐缩小。待湖羊毛乳头细胞生长趋于稳定后，培养３－４天的８０－９０％并可进行传代。与此同时，随着传代次数的增加，毛乳类似成纤维细胞，但胞体比成纤维细胞体胞大，且呈漩涡状生Ａ?Ｂ??
【参考文献】：
期刊论文
[1]藏绵羊不同毛色皮肤组织miRNA表达谱及靶基因分析[J]. 吴震洋,唐晓惠,付玉华,王昇,章程,李京津,余梅,杜小勇. 中国农业科学. 2018(02)
[2]羊生产性状相关microRNA的研究进展[J]. 杨灵芝,巩佳昕,刘念,祁琪,王健,沈露露,房兴堂,李勇,李忠昌. 黑龙江畜牧兽医. 2017(21)
[3]长毛兔毛乳头细胞的分离培养及生长特性研究[J]. 白莉雅,孙海涛,呼红梅,杨丽萍,高淑霞,姜文学. 家畜生态学报. 2017(10)
[4]不同品种羊miR-1298-5p及其潜在靶基因TGF-βR1表达的比较研究[J]. 张桂山,徐晶,孙丽敏,白曼,项露杰,姜怀志. 中国农学通报. 2017(27)
[5]microRNA-10a/b通过抑制Mib1调节斑马鱼神经元的发育[J]. 吕峰,石运伟,王新,刘东,严兴洪. 中国细胞生物学学报. 2017(02)
[6]生长因子EGF、aFGF、bFGF对毛乳头细胞生长的研究[J]. 潘霄汝,张汝芝,金慧玲. 齐齐哈尔医学院学报. 2017(02)
[7]BMP7基因在细毛羊皮肤毛囊中的表达及与羊毛性状的关系[J]. 王小佳,贺建宁,程明,刘开东,柳楠. 中国畜牧杂志. 2016(19)
[8]MicroRNA-148b promotes proliferation of hair follicle cells by targeting NFAT5[J]. Wanbao YANG,Qinqun LI,Bo SU,Mei YU. Frontiers of Agricultural Science and Engineering. 2016(01)
[9]毛乳头细胞的研究现状[J]. 苏胤杰,杨劲,张艺,星懿展. 医学综述. 2014(01)
[10]miRNA在调控皮肤和毛囊发育中的作用[J]. 蔡婷,刘志红,王志新,赵濛,俎红丽,李金泉. 遗传. 2013(09)
博士论文
[1]过表达miR-148a对猪体细胞重编程及其核移植胚胎发育影响的初步研究[D]. 王萍.广西大学 2017
[2]内蒙古绒山羊皮肤毛囊毛乳头细胞系的建立及其基因表达谱型的研究[D]. 朱兵.内蒙古大学 2014
[3]骨骼肌发育中miR-148a功能与qPCR内参基因的研究[D]. 张晶.华中农业大学 2012
硕士论文
[1]miR-let7a在辽宁绒山羊毛囊发育周期中的差异表达及其靶基因功能鉴定[D]. 江倩.吉林大学 2015
[2]绵羊MIR-148b和MIR-320对毛囊发育调控研究[D]. 李勤群.华中农业大学 2014
[3]IGF-1、FGF7与毛乳头细胞生物学特性的相关性及复方甘草酸苷、地塞米松对毛乳头细胞活性影响的研究[D]. 程毅.河北医科大学 2010
[4]毛乳头细胞及其部分相关生长因子的研究[D]. 李玲.河北医科大学 2010
本文编号：2971023
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