坦布苏病毒的分离鉴定及重组腺病毒介导shRNA抑制坦布苏病毒在体外复制的研究

发布时间：2021-01-11 21:32

　　坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）是导致肉鸭神经症状及产蛋鸭出血性卵巢炎（duck hemorrhagic ovaritis，DHO）的主要病原，主要引起20日龄以内的雏鸭出现严重的神经症状，死淘率增高及产蛋鸭的产蛋大幅下降。发病雏鸭通常表现为采食量下降，腹泻，共济失调，瘫痪等症状。发病蛋鸭体温升高；四肢无力、瘫痪；食欲废绝；发病后不久开始产蛋大幅下降；发病后期排草绿色稀便，气味恶臭，出现神经症状。剖检可见卵泡破裂出血，卵黄性腹膜炎，脾脏出血，胰腺出血坏死，肝脏肿大、出血。TMUV属于黄病毒科黄病毒属蚊媒病毒类的恩塔亚病毒群，是一种具有包膜的单股正链RNA病毒，通过节肢动物的叮咬进行传播而导致宿主发病。病毒的基因组全长约为11kb，包含5’和3’的非编码区，仅含有一个开放阅读框（Open reading frame，ORF），编码3种结构蛋白和8种非结构蛋白。其中包膜蛋白（Envelop protein，E）蛋白是病毒的主要结构蛋白，与病毒的吸附，融合，注入，血凝性及宿主范围和细胞嗜性有密切关系；NS5蛋白为TMUV分子量最大的蛋白，也是最保守的蛋白，它具有RNA依赖的... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：118 页

【学位级别】：博士

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符号说明
中文摘要
ABSTRACT
1 引言
    1.1 坦布苏病毒病概述
    1.2 TMUV 的生物学特性
        1.2.1 TMUV 的分类地位
        1.2.2 黄病毒的形态结构
        1.2.3 黄病毒的基因组及编码蛋白
        1.2.4 黄病毒的复制机制
        1.2.5 黄病毒基因组末端倒置互补序列
        1.2.6 TMUV 的研究进展
    1.3 RNAi 研究进展
        1.3.1 RNAi 概念
        1.3.2 RNAi 在抗病毒治疗中的应用
        1.3.3 黄病毒 RNAi 研究进展
    1.4 腺病毒载体研究进展
    1.5 研究的目的意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 病毒株及抗体
        2.1.2 实验动物及细胞
        2.1.3 主要试剂、试剂盒及化学药品
        2.1.4 试剂的配制
        2.1.5 载体
        2.1.6 主要仪器设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 TMUV 半套式 RT-PCR 检测方法的建立与应用
        2.2.2 TMUV RT-LAMP 检测方法的建立与应用
        2.2.3 TMUV 多种核酸检测方法的比较
        2.2.4 不同宿主来源的 TMUV 的分离与鉴定
        2.2.5 TMUV 山东分离株 SD1001 全基因序列测定
        2.2.6 靶向干扰 TMUV E 基因和 NS5 基因的 shRNA 序列的筛选
        2.2.7 干扰 TMUV 复制的重组腺病毒的构建与鉴定及体外干扰试验
3 结果
    3.1 TMUV 半套式 RT-PCR 检测方法的建立与应用
        3.1.1 半套式 RT-PCR 检测方法的特异性试验结果
        3.1.2 半套式 RT-PCR 检测方法的敏感性
        3.1.3 半套式 RT-PCR 对 TMUV 临床样品的检测结果
    3.2 TMUV RT-LAMP 检测方法的建立与应用
        3.2.1 TMUV RT-LAMP 检测方法的敏感性试验结果
        3.2.2 TMUV RT-LAMP 检测方法的特异性试验结果
        3.2.3 临床样品检测结果
    3.3 TMUV 多种核酸检测方法的比较
        3.3.1 多种检测方法的敏感性试验结果
        3.3.2 多种检测方法的特异性试验结果
        3.3.3 临床样品检测结果
    3.4 不同宿主来源的 TMUV 的分离与鉴定
        3.4.1 不同宿主来源的 TMUV 流行病学调查
        3.4.2 麻雀分离株 TMUV-SDHS 鸭胚培养特性
        3.4.3 麻雀分离株 TMUV-SDHS 细胞培养特性
        3.4.4 蚊源分离株 TMUV-SDHS 细胞培养特性
        3.4.5 TMUV-SDHS 的 E 基因和 NS5 基因的遗传进化分析结果
        3.4.6 TMUV-SDHS 及 TMUV-SDMS 株对产蛋鸭致病性研究结果
    3.5 TMUV 山东分离株 SD1001 全基因序列测定
        3.5.1 TMUV 基因组分析结果
        3.5.2 TMUV 病毒的蛋白的氨基酸比对结果
        3.5.3 TMUV 5’末端和 3’末端非编码区的分析
        3.5.4 TMUV 病毒的蛋白的潜在糖基化位点预测
        3.5.5 TMUV 开放阅读框 Bootscan 扫描
    3.6 靶向干扰 TMUV E 基因和 NS5 基因的 shRNA 序列的筛选
        3.6.1 重组载体 pEGFP-E 及 pEGFP-NS5 载体的测序鉴定
        3.6.2 转染用细胞的选择
        3.6.3 荧光标签载体转染 293T 细胞
        3.6.4 shRNA 干扰 E-GFP 和 NS5-GFP 融合蛋白的表达
        3.6.5 shRNA 干扰载体与 GFP 融合蛋白的表达载体共转染后的流式细胞检测
        3.6.7 E 基因和 NS5 基因的相对荧光定量检测结果
    3.7 干扰 TMUV 复制的重组腺病毒的构建与鉴定及体外干扰试验
        3.7.1 重组腺病毒的包装出毒
        3.7.2 重组腺病毒的鉴定
        3.7.3 重组腺病毒滴度的测定
        3.7.4 重组腺病毒介导的 shRNA 体外干扰 TMUV 复制的研究
4 讨论
    4.1 TMUV 核酸检测方法的建立及多种核酸检测方法的比较
        4.1.1 TMUV 半套式 RT-PCR 检测方法的建立与应用
        4.1.2 TMUV RT-LAMP 检测方法的建立与应用
        4.1.3 TMUV 多种核酸检测方法的比较
    4.2 不同宿主来源的 TMUV 的分离与鉴定
    4.3 TMUV 山东分离株 SD1001 全基因序列测定
    4.4 重组腺病毒介导的 shRNA 干扰 TMUV 复制的研究
5 结论
参考文献
附录
致谢
博士在读期间发表论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭出血性卵巢炎的初步研究[J]. 曹贞贞,张存,黄瑜,刁有祥,叶伟成,刘月焕,韩婧文,马国明,张冬冬,许丰,王丹,姜甜甜,袁媛,谢小雨,高绪慧,唐熠,施少华,万春和,张晨,何玢,杨梦婕,陆新浩,张冰,张国中,马学军,张大丙.  中国兽医杂志. 2010(12)
[2]以AdMax载体系统构建和制备肾癌相关抗原G250基因重组腺病毒表达载体[J]. 齐桓.  南方医科大学学报. 2008(09)



本文编号：2971508