牛支原体单克隆抗体、核酸适配体的筛选及应用

发布时间：2021-01-11 23:21

　　牛支原体是牛的一种常见却常被忽视的致病性病原,常导致牛只呼吸性疾病、乳房炎、关节炎等疾病。自2008年在湖北省首次发现以来,我国已超过10省份均有牛支原体暴发的报道。牛群在长距离运输后更易发病,感染率为50%-100%,致死率高达10%-50%,给我国养牛业造成严重的经济损失。适配体（Aptamer）是由指数富集配体系统进化（Systematic Evaluation Ligands by Exponential Enrichment,SELEX）技术筛选而来的DNA或RNA单链分子,它可以以类似抗原-抗体的方式与靶物质特异性结合。本研究使用原核表达的P48蛋白进行牛支原体单克隆抗体的筛选。筛选得到的单克隆抗体株10E可识别所有牛支原体菌株（模式株PG45,中国分离株Hubei-1、SD-2、GY-2、PD-2、HRB-1、HY-1、HG-1）,与其它相关病原（无乳支原体、精氨酸支原体、牛鼻支原体、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛腺病毒3型）无交义反应,亲和力高达6×1010 L/M。我们同样采用微孔板作为介质,成功筛选到了 P48蛋白高亲和力、高特异性单链... 

【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：110 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
    1.1 SELEX技术
        1.1.1 分离技术
        1.1.2 单链制备
        1.1.3 结合力的测定
    1.2 基于适配体的检测应用平台
        1.2.1 光学适配体生物传感器
        1.2.2 质量灵敏传感器
        1.2.3 电化学适配体传感器
        1.2.4 酶联适配体学说
        1.2.5 纳米材料传感器
    1.3 牛支原体
        1.3.1 病原学
        1.3.2 流行病学
        1.3.3 牛支原体膜蛋白研究现状
        1.3.4 牛支原体的检测
    1.4 研究目的与意义
第二章 原核表达牛支原体P48蛋白
    2.1 材料
        2.1.1 菌株及实验动物
        2.1.2 仪器
        2.1.3 试剂
    2.2 方法
        2.2.1 牛支原体全基因组DNA的提取
        2.2.2 P48基因扩增及测序
        2.2.3 P48基因定点突变
        2.2.4 P48蛋白表达及纯化
        2.2.5 Western Blotting验证P48蛋白
    2.3 结果
        2.3.1 P48基因的扩增
        2.3.2 P48基因测序
        2.3.3 基因定点突变
        2.3.4 P48蛋白原核表达及纯化
        2.3.5 Western Blotting
    2.4 讨论
        2.4.1 关于P48蛋白
        2.4.2 关于P48基因突变
        2.4.3 关于选择pET28 a（+）)质粒
    2.5 小结
第三章 牛支原体P48蛋白单克隆抗体的筛选
    3.1 材料
        3.1.1 菌株、毒株及实验动物
        3.1.2 仪器
        3.1.3 试剂
    3.2 方法
        3.2.1 小鼠免疫
        3.2.2 间接ELISA的建立
        3.2.3 杂交瘤细胞株的建立
        3.2.4 单克隆抗体的生产
        3.2.5 单抗特性的鉴定
    3.3 结果
        3.3.1 间接ELISA抗原浓度、一抗血清稀释度的优化以及6只免疫小鼠抗体效价的测定
        3.3.2 阴阳性临界值的确定
        3.3.3 杂交瘤细胞株的建立
        3.3.4 单抗的鉴定和特性分析
    3.4 讨论
        3.4.1 关于小鼠免疫
        3.4.2 关于亚克隆
        3.4.3 关于表位
        3.4.4 关于特异性
    3.5 小结
第四章 P48蛋白核酸适配体的筛选
    4.1 材料
        4.1.1 仪器
        4.1.2 试剂
        4.1.3 溶液的配制
    4.2 方法
        4.2.1 CE-SELEX
        4.2.2 镍树脂SELEX
        4.2.3 微孔板SELEX
    4.3 结果
        4.3.1 CE-SELEX结果
        4.3.2 镍树脂法结果
        4.3.3 微孔板法筛选适配体
    4.4 讨论
        4.4.1 关于筛选方法
        4.4.2 关于鉴定方法
        4.4.3 关于二级结构
    4.5 小结
第五章 应用适配体、单克隆抗体建立牛支原体抗体检测方法
    5.1 材料
    5.2 方法
        5.2.1 单抗10E和适配体WKB-14比较
        5.2.2 直接竞争ELISA （Dc-ELISA）的建立
        5.2.3 间接竞争ELAA （Ic-ELAA）方法的建立
        5.2.4 检测牛血清临床样本
    5.3 结果
        5.3.1 mAb 10E与WKB-14敏感性与特异性比较
        5.3.2 Dc-ELISA方法的建立
        5.3.3 Ic-ELAA方法的建立
        5.3.4 临床牛血清检测
    5.4 讨论
        5.4.1 关于mAb 10E与适配体WKB-14比较
        5.4.2 关于特异性
        5.4.3 关于Ic-ELAA
        5.4.4 关于五种血清学方法比较
    5.5 小结
第六章 结论
第七章 创新点
参考文献
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]适配体及其研究进展[J]. 王周平,张维潇.  食品与生物技术学报. 2013(09)
[2]牛支原体生物学特性及其膜蛋白的研究进展[J]. 陈忠琼,范媛,黎晓敏.  中国畜牧兽医. 2012(02)
[3]应用巢式PCR方法检测牛支原体肺炎[J]. 李大伟,张彦明,黄灿平,谢建华,熊仲良,冉智光,关平原,范伟兴.  中国动物检疫. 2010(04)
[4]西昌某牛场疑似牛支原体肺炎RT-PCR方法的诊断[J]. 尹灿友.  西昌学院学报(自然科学版). 2010(01)
[5]我国部分地区牛支原体肺炎和关节炎的病原体诊断[J]. 冉智光,谢建华,骆璐,杨泽林,凌洪权,苏承忠,熊仲良,范伟兴,米自由.  中国预防兽医学报. 2010(01)
[6]基于毛细管电泳的细胞SELEX方法的初步建立[J]. 徐华,李少华,郭磊,张朝阳,谢剑炜,邵宁生.  军事医学科学院院刊. 2009(05)
[7]牛支原体病研究进展[J]. 胡长敏,石磊,龚瑞,白智迪,郭爱珍.  动物医学进展. 2009(08)
[8]支原体感染与细胞凋亡的研究进展[J]. 宋娟.  当代医学. 2009(12)
[9]适配体筛选方法研究进展[J]. 王巍,贾凌云.  分析化学. 2009(03)
[10]肉牛传染性牛支原体肺炎流行的诊断[J]. 石磊,龚瑞,尹争艳,周勇,裴洁,胡智斌,王利霞,胡长敏,刘涛,陈颖钰,廖娟红,赵俊龙,陈焕春,郭爱珍.  华中农业大学学报. 2008(05)

博士论文
[1]体外筛选炭疽杆菌芽孢适配子的研究与初步应用[D]. 甄蓓.第一军医大学 2002



本文编号：2971671