坦布苏病毒感染的鸭胚成纤维中长链非编码RNA的表达谱变化及其功能初步研究
发布时间：2021-01-12 23:54
坦布苏病毒（Tembusu Virus,TMUV）感染是由TMUV引起的一种新发传染性疾病。该病自2010年起持续危害我国水禽养殖业,造成严重经济损失。长链非编码RNA（long non-coding RNA,1ncRNA）是一类长度大于200个核苷酸,缺乏编码能力的RNA,最近大量研究报道其具有多种生物学功能,在病毒感染过程中发挥着重要的调控作用。为探究lncRNA在TMUV感染中的可能作用,本研究以鸭胚成纤维细胞（duck embryo fibroblast cells,DEFs）为试验材料,利用高通量RNA测序（RNA-Seq）技术揭示TMUV感染诱导的lncRNA表达谱变化,通过生物信息学手段预测差异表达1ncRNA的生物学功能,并对筛选的差异表达1ncRNA进行表达验证和初步的功能研究。主要内容如下:1、为探讨TMUV感染DEFs后病毒的复制情况与宿主细胞的生物学特性变化,本研究利用DEFs为研究对象,分别接种3 MOI的TMUV,并在l2 hpi,24 hpi和48 hpi检测病毒复制、细胞周期和细胞凋亡三个生物学指标。结果表明,随着病毒感染时间的延长,细胞中的病毒滴度逐渐...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
黄病毒的结构示意图(Heinzetal.,2012)
山东农业大学硕士学位论文9可以作为诱饵捕获转录因子，从而调节转录因子的活性(Bondetal.,2009)。例如，Evf-2可以作为关键激活因子激活参与转录过程的蛋白，调节同源盒转录因子2（DLX2）和热休克蛋白（HSP）的转录(Fengetal.,2006)。除了作为正转录调节因子，有一些1ncRNA也可以作为转录抑制因子发挥作用。例如，周期蛋白D1（CCND1）能够在病理状态下产生多种lncRNA，它们能够与RNA结合蛋白脂肪肉瘤转运蛋白（TLS），导致其蛋白构象发生改变，进而使CCND1转录障碍，阻止了细胞进程(Wangetal.,2008)。除了表观遗传和转录调控，1ncRNA能够调控转录后的基因表达，包括可变剪切、编辑、翻译以及转运等mRNA事件(Moore.,2005)。在某些情况下，1ncRNA与己知蛋白编码基因形成RNA互补双链，成为mRNA的重叠基因中关键顺式调控元件，导致正义链的可变剪切(Beltranetal.,2008)。1ncRNA可以通过调节翻译过程在转录后水平增加蛋白质的合成(Carrierietal.,2012;Liuetal.,2002)。有的1ncRNA通过改变蛋白质的亚细胞定位来调控蛋白活性(Willinghametal.,2005)。lncRNA也可以作为miRNA的海绵竞争结合miRNA，从而上调miRNA靶基因的表达(Hansenetal.,2013)。图3lncRNA的功能模式(www.serengeseba.com)Fig.3ThefunctionpatternoflncRNA1.3.4lncRNA的作用机制1ncRNA可以作为信号分子、诱饵分子、支架分子和引导分子发挥基因调控作用。作为信号分子，1ncRNA的转录具有组织和时空特异性，可以在不同的细胞中对不同刺激做出特异性反应。作为诱饵分子，1ncRNA能够与染色质修饰因子、转录因子以及剪切因子形成蛋白复合体，起到负调节效应器的作用，防止调节蛋白对基因表达的调控(Martianovetal.,2007)。作为支架分子，1ncRNA可以将相关效应分子组分组合成复合
坦布苏病毒感染的鸭胚成纤维细胞中长链非编码RNA的表达谱变化及其功能初步研究20图4RNA-Seq的流程Fig.4ProcessofRNA-Seq2.2.2.2原始数据的整理、过滤及质量评估样品通过上述RNA-Seq流程可以获得下机数据，即原始数据（RawData）。通过统计各样品的RawData，例如样品名称、模糊碱基所占百分比（N(%)）、碱基识别准确率在99%以上的碱基所占百分比（Q20(%)）、碱基识别准确率在99.9%以上的碱基总数（Q30）以及碱基识别准确率在99.9%以上的碱基所占百分比（Q30(%)）等，可以对测序质量进行初步评估。RawData中混有一部分带接头或者低质量的序列，它们的存在对后续的生物信息学分析产生一定的误差，因此有必要去除这些低质量的数据。利用Cutadapt软件对原始数据进行接头序列、低质量序列和重复冗余序列的去杂。通过Bowtie2和Tophat2软件建立参考基因组索引并将高质量序列比对到参考基因组。Tophat2比对时，默认序列和参考基因组序列的Mismatch在2个之内，即为Mapping成功。如果Mapping比例大于70%，不仅说明参考基因组选择合格，而且能确定实验过程中没有污染。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Analysis of Expression Profiles of Long Noncoding RNAs and mRNAs in A549 Cells Infected with H3N2 Swine Influenza Virus by RNA Sequencing[J]. Yina Zhang,Tianqi Yu,Yingnan Ding,Yahui Li,Jing Lei,Boli Hu,Jiyong Zhou. Virologica Sinica. 2020(02)
[2]Regulation of cell survival and death during Flavivirus infections[J]. Sounak Ghosh Roy,Beata Sadigh,Emmanuel Datan,Richard A Lockshin,Zahra Zakeri. World Journal of Biological Chemistry. 2014(02)
本文编号：2973794
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
黄病毒的结构示意图(Heinzetal.,2012)
山东农业大学硕士学位论文9可以作为诱饵捕获转录因子，从而调节转录因子的活性(Bondetal.,2009)。例如，Evf-2可以作为关键激活因子激活参与转录过程的蛋白，调节同源盒转录因子2（DLX2）和热休克蛋白（HSP）的转录(Fengetal.,2006)。除了作为正转录调节因子，有一些1ncRNA也可以作为转录抑制因子发挥作用。例如，周期蛋白D1（CCND1）能够在病理状态下产生多种lncRNA，它们能够与RNA结合蛋白脂肪肉瘤转运蛋白（TLS），导致其蛋白构象发生改变，进而使CCND1转录障碍，阻止了细胞进程(Wangetal.,2008)。除了表观遗传和转录调控，1ncRNA能够调控转录后的基因表达，包括可变剪切、编辑、翻译以及转运等mRNA事件(Moore.,2005)。在某些情况下，1ncRNA与己知蛋白编码基因形成RNA互补双链，成为mRNA的重叠基因中关键顺式调控元件，导致正义链的可变剪切(Beltranetal.,2008)。1ncRNA可以通过调节翻译过程在转录后水平增加蛋白质的合成(Carrierietal.,2012;Liuetal.,2002)。有的1ncRNA通过改变蛋白质的亚细胞定位来调控蛋白活性(Willinghametal.,2005)。lncRNA也可以作为miRNA的海绵竞争结合miRNA，从而上调miRNA靶基因的表达(Hansenetal.,2013)。图3lncRNA的功能模式(www.serengeseba.com)Fig.3ThefunctionpatternoflncRNA1.3.4lncRNA的作用机制1ncRNA可以作为信号分子、诱饵分子、支架分子和引导分子发挥基因调控作用。作为信号分子，1ncRNA的转录具有组织和时空特异性，可以在不同的细胞中对不同刺激做出特异性反应。作为诱饵分子，1ncRNA能够与染色质修饰因子、转录因子以及剪切因子形成蛋白复合体，起到负调节效应器的作用，防止调节蛋白对基因表达的调控(Martianovetal.,2007)。作为支架分子，1ncRNA可以将相关效应分子组分组合成复合
坦布苏病毒感染的鸭胚成纤维细胞中长链非编码RNA的表达谱变化及其功能初步研究20图4RNA-Seq的流程Fig.4ProcessofRNA-Seq2.2.2.2原始数据的整理、过滤及质量评估样品通过上述RNA-Seq流程可以获得下机数据，即原始数据（RawData）。通过统计各样品的RawData，例如样品名称、模糊碱基所占百分比（N(%)）、碱基识别准确率在99%以上的碱基所占百分比（Q20(%)）、碱基识别准确率在99.9%以上的碱基总数（Q30）以及碱基识别准确率在99.9%以上的碱基所占百分比（Q30(%)）等，可以对测序质量进行初步评估。RawData中混有一部分带接头或者低质量的序列，它们的存在对后续的生物信息学分析产生一定的误差，因此有必要去除这些低质量的数据。利用Cutadapt软件对原始数据进行接头序列、低质量序列和重复冗余序列的去杂。通过Bowtie2和Tophat2软件建立参考基因组索引并将高质量序列比对到参考基因组。Tophat2比对时，默认序列和参考基因组序列的Mismatch在2个之内，即为Mapping成功。如果Mapping比例大于70%，不仅说明参考基因组选择合格，而且能确定实验过程中没有污染。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Analysis of Expression Profiles of Long Noncoding RNAs and mRNAs in A549 Cells Infected with H3N2 Swine Influenza Virus by RNA Sequencing[J]. Yina Zhang,Tianqi Yu,Yingnan Ding,Yahui Li,Jing Lei,Boli Hu,Jiyong Zhou. Virologica Sinica. 2020(02)
[2]Regulation of cell survival and death during Flavivirus infections[J]. Sounak Ghosh Roy,Beata Sadigh,Emmanuel Datan,Richard A Lockshin,Zahra Zakeri. World Journal of Biological Chemistry. 2014(02)
本文编号：2973794
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