小鼠zfx基因RNAi片段的筛选及性控效果的观察

发布时间：2021-01-13 00:11

　　睾丸是精子生成和分泌雄性激素的场所，是雄性哺乳动物最重要的生殖器官。小鼠的zfx基因位于X染色体短壁上的性别决定区（TDF）内，是锌脂蛋白家族中的一员。zfx可以作为一个较强的转录激活因子，从而引导靶基因通过核膜定位在X精子的细胞核内，可能对某些基因在X精子发生过程中具有转录激活作用，与X精子的形成发生有关。本研究根据zfx基因的特点，设计了4个shRNA片段，进行小鼠体外和体内zfx基因的RNAi实验，采用qRT-PCR分析干扰后zfx基因的mRNA表达水平，并统计了经干扰后子代小鼠的性别比例。具体研究结果如下：1.根据GenBank（NCBI）提供的完整的小鼠zfx基因mRNA序列，按照RNAi设计原则，针对该基因的编码区设计并合成4对shRNA干扰片段。以Clontech公司（USA）RNAi-Ready-pSIREN-RetroQ-ZsGreen作为载体，构建了小鼠靶向zfx基因的shRNA表达载体pqz1-paz4。经过酶切鉴定和测序证实，实验所构建的4个表达载体中含有设计合成的干扰序列，且上下游表达调控元件完整，插入序列的位置正确。说明这4个shRNA表达载体构建成功，可以... 

【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
论文中常用缩写词英汉对照表
前言
综述部分
    一、动物性别控制的研究
    二 RNA干扰的原理、机制及其在动物繁殖中的应用
        1. RNAi的发展史
        2. RNAi的作用机理
            2.1 参与RNAi机制的的主要分子
                2.1.1 dsRNA分子
                2.1.2 Dicer酶
                2.1.3 siRNA分子
                2.1.4 RISC
                2.1.5 RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）
            2.2 RNAi作用机制
        3. siRNAs的常见制备
            3.1 化学合成
            3.2 siRNA 表达载体
            3.3 用RNaseIII消化大片断dsRNA制备siRNA
            3.4 体外转录
            3.5 siRNA表达框架
        4. siRNA的介导途径
        5. 检测RNAi结果的方法
        6. RNAi技术在动物繁殖中的应用
            6.1 RNAi应用于动物卵母细胞
            6.2 RNAi应用与精子发生
            6.3 RNAi与动物的胚胎发育
        7. 展望
试验研究
    实验一 小鼠zfx基因shRNA表达载体的构建
        1. 材料与方法
            1.1 主要仪器
            1.2 主要试剂
            1.3 方法
        2. 结果与分析
            2.1 目标序列的初步筛选
            2.2 表达载体的克隆与酶切鉴定
            2.3 重组质粒表达载体的测序鉴定
        3. 讨论
            3.1 RNAi的作用原理
            3.2 siRNA的设计原则
            3.3 重组表达质粒的检测
    实验二 zfx基因shRNA表达载体的细胞RNA干扰试验
        1. 材料与方法
            1.1 主要试剂
            1.2 主要仪器
            1.3 主要PCR引物
            1.4 主要实验动物
        2. 主要实验方法
            2.1 重组表达质粒的大量制备与纯化
            2.2 生精细胞的分离与培养
            2.3 重组表达质粒转染生精细胞
            2.4 测定生精细胞zfx基因mRNA表达水平
        3. 结果与分析
            3.1 重组表达质粒转染生精细胞
            3.2 PCR结果分析
            3.3 zfxmRNA表达水平
        4. 讨论
    实验三 zfx基因shRNA表达载体的体内RNA干扰试验
        1. 材料与方法
            1.1 主要试剂
            1.2 主要仪器
            1.3 主要实验动物
            1.4 zfx基因shRNA重组表达载体的构建
            1.5 主要PCR引物
            1.6 重组表达质粒的大量制备与纯化
            1.7 小鼠体内zfx基因RNAi实验
            1.8 测定睾丸中zfx基因mRNA表达水平
        2. 结果与分析
            2.1 PCR结果分析
            2.2 小鼠睾丸中zfxmRNA表达水平
            2.3 F1代小鼠的性别比例
        3. 讨论
参考文献
结论
创新点
致谢
作者简介
导师评阅表



本文编号：2973820