J亚群禽白血病病毒致病性增强的分子机制
发布时间：2021-01-13 17:00
J亚群禽白血病是由J亚群禽白血病病毒（ALV-J）引起的一类禽肿瘤性疾病。自1988年从鸡中首次分离ALV-J以来，ALV-J在世界各地鸡群广泛流行。欧美国家通过净化措施几乎在鸡群中根除ALV-J,但ALV-J自1999年传入我国鸡群后，就一直在鸡群中流行，特别是2008年以来，ALV-J在我国一些蛋鸡群中暴发，发病率高达60%，致鸡死亡率超过30%，其主要引起临床症状为血管瘤及各实质脏器肿瘤，由于禽白血病是垂直传播为主的种原性疾病，一些种禽场纷纷被告倒闭。ALV-J给我国养禽业造成的严重损失，受到了政府和养殖业的广泛关注。本研究以流行病学和ALV-J基因组遗传演化分析为突破口，运用反向遗传技术阐明了ALV-J致病力增强的分子基础，并从ALV-J与宿主互作角度解析了ALV-J致病性增强的分子机制。本研究首先在我国ALV-J暴发的疫区进行系统流行病学调查，共分离鉴定了16株ALV-J蛋鸡分离株，遗传演化分析发现，ALV-J蛋鸡分离株较早期ALV-J肉鸡分离株有多个基因发生了突变或缺失，其中77.8%（21/27）的ALV-J蛋鸡分离株env基因存在显著差异；虽然U3区中转录元件都较为保守...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：124 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
附件
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 禽白血病
1.2 我国 J 亚群禽白血病的流行情况
1.3 J 亚群禽白血病病毒
1.3.1 病毒的分类地位
1.3.2 病毒的形态与理化特性
1.3.3 病毒的基因组结构及蛋白组成
1.3.4 病毒复制周期
1.3.5 病毒致病致瘤机制
1.4 血管内皮生长及其受体与肿瘤发生
1.4.1 血管内皮生长因子 A 与血管生成
1.4.2 血管内皮生长因子受体 2 与血管生成
1.4.3 血管生成与肿瘤发生
1.5 p53 与病毒及肿瘤
1.5.1 认知 p53
1.5.2 p53 基因突变与肿瘤
1.5.3 病毒与 p53
1.5.4 p53 与病毒引起的禽类肿瘤
1.6 microRNAs 与反转录病毒
1.6.1 microRNAs 的发现与命名
1.6.2 microRNAs 的生成与调控机制
1.6.3 microRNAs 与反转录病毒
1.7 本研究的目的与意义
第二章 我国 ALV-J 遗传演化分析
2.1 实验材料
2.1.1 载体、菌株和细胞
2.1.2 临床样品
2.1.3 主要试剂
2.1.4 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 病毒分离与前病毒 DNA 提取
2.2.2 病毒基因克隆与测序
2.2.3 DNA 序列比对及进化树分析
2.3 实验结果
2.3.1 ALV-J 的病毒分离及鉴定
2.3.2 ALV-J env 基因的遗传演化分析
2.3.3 ALV-J U3 的进化分析
2.3.4 ALV-J 3’UTR 的进化分析
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 3’UTR 205nt 缺失增强 ALV-J 致病性
3.1 实验材料
3.1.1 载体、菌株和细胞
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.2 实验方法
3.2.1 ALV-J 感染性克隆构建策略
3.2.2 病毒拯救和鉴定
3.2.3 拯救病毒的体外复制动力学
3.2.4 p27 蛋白表达和反转录酶活性鉴定
3.2.5 亚病毒基因组构建
3.2.6 亚病毒基因组中 p27 蛋白的表达和未剪切 RNA 的核质穿梭
3.2.7 拯救病毒的体内致病性
3.2.8 数据分析
3.3 实验结果
3.3.1 拯救缺失 205nt 和嵌合 205nt 的两株 ALV-J 病毒
3.3.2 205nt 缺失增强 ALV-J 在血管内皮细胞中的复制
3.3.3 205nt 缺失促进 ALV-J 未剪切 RNA 从细胞核输出到细胞质
3.3.4 205nt 缺失增强 ALV-J 在体内的复制
3.3.5 205nt 缺失增强 ALV-J 致瘤性和致死率
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 ALV-J 致病性增强的分子机制
4.1 实验材料
4.1.1 载体、菌株和细胞
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.2 实验方法
4.2.1 VEGF-A 和 VEGFR-2 表达
4.2.2 ALV-J 病毒载量及其插入位点的鉴定
4.2.3 p21WAF1的表达和 p53 表达载体的构建
4.2.4 DF-1 原型 p53 蛋白和突变型 p53 蛋白的细胞定位
4.2.5 U3 介导的报告基因载体和亚病毒基因组构建
4.2.6 亚病毒基因组中 p27 蛋白的表达和未剪切 RNA 的核质穿梭
4.2.7 染色体免疫共沉淀（CHIP）验证 p53 蛋白与 ALV-J U3 互作
4.2.8 凝胶阻滞试验（EMSA）验证 p53 蛋白与 U3 互作作用域
4.2.9 数据分析
4.3 实验结果
4.3.1 ALV-J 致瘤组织中 VEGF-A 及其受体 VEGFR-2 高水平表达
4.3.2 VEGF-A 和 VEGFR-2 表达水平与 ALV-J 复制呈正相关
4.3.3 ALV-J 持续感染致 TP53 基因突变
4.3.4 DF-1 细胞中原型 p53 蛋白抑制 ALV-J U3 活性
4.3.5 突变型 p53 蛋白失去对抑制 ALV-J 复制的作用
4.3.6 ALV-J 感染 DF-1 细胞增加 DF-1 原型 p53 蛋白表达
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 宿主 miRNAs 在 ALV-J 致病过程中的作用
5.1 实验材料
5.1.1 载体、菌株，毒株和细胞
5.1.2 主要试剂
5.1.3 主要仪器
5.2 实验方法
5.2.1 预测 ALV-J 基因组编码 miRNAs 的预测
5.2.2 预测 ALV-J 编码 miRNAs 前体分子的验证
5.2.3 原型及突变型报告基因的构建和检测
5.2.4 预测 miRNA 与靶标的结合
5.2.5 宿主 miRNAs 抑制子和表达载体的构建
5.2.6 宿主 miRNAs 的 Northern Blot 验证
5.2.7 原型 ALV-J 和突变型 ALV-J 的拯救
5.2.8 ALV-J p27 蛋白的表达及病毒复制
5.2.9 宿主 gga-miR-1650 茎环法荧光定量 PCR 检测
5.2.10 数据分析
5.3 实验结果
5.3.1 ALV-J 基因组中 miRNAs 前体分子预测
5.3.2 Northern Blot 检测不到预测的 ALV-J 编码的前体分子
5.3.3 DF-1 细胞中可能存在 miRNAs 调控 ALV-J 5’UTR 介导的报告基因活性
5.3.4 gga-miR-1650 调控 5’UTR 介导的报告基因活性
5.3.5 ALV-J 5’UTR 是 gga-miR-1650 的靶标
5.3.6 过表达 gga-miR-1650 抑制 ALV-J 蛋白表达和病毒复制
5.3.7 ALV-J 感染引起细胞 gga-miR-1650 表达上调
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查[J]. 高玉龙,邵华斌,罗青平,潘伟,秦立廷,孙芬芬,刘超男,高宏雷,祁小乐,王笑梅. 中国预防兽医学报. 2010(01)
[2]中国麻鸡中发现禽J亚群白血病[J]. 成子强,张利,刘思当,张玲娟,崔治中. 微生物学报. 2005(04)
[3]突变型抑癌基因p53在蛋鸡J亚群禽白血病中的表达[J]. 徐镔蕊,董卫星,何召庆,余春明,李宁,冯小宇,L.F.Lee,Maoxiang Li. 农业生物技术学报. 2003(03)
博士论文
[1]蛋鸡ALV-J的分离鉴定及分子致瘤机制的研究[D]. 曲悦.山东农业大学 2012
本文编号：2975236
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：124 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
附件
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 禽白血病
1.2 我国 J 亚群禽白血病的流行情况
1.3 J 亚群禽白血病病毒
1.3.1 病毒的分类地位
1.3.2 病毒的形态与理化特性
1.3.3 病毒的基因组结构及蛋白组成
1.3.4 病毒复制周期
1.3.5 病毒致病致瘤机制
1.4 血管内皮生长及其受体与肿瘤发生
1.4.1 血管内皮生长因子 A 与血管生成
1.4.2 血管内皮生长因子受体 2 与血管生成
1.4.3 血管生成与肿瘤发生
1.5 p53 与病毒及肿瘤
1.5.1 认知 p53
1.5.2 p53 基因突变与肿瘤
1.5.3 病毒与 p53
1.5.4 p53 与病毒引起的禽类肿瘤
1.6 microRNAs 与反转录病毒
1.6.1 microRNAs 的发现与命名
1.6.2 microRNAs 的生成与调控机制
1.6.3 microRNAs 与反转录病毒
1.7 本研究的目的与意义
第二章 我国 ALV-J 遗传演化分析
2.1 实验材料
2.1.1 载体、菌株和细胞
2.1.2 临床样品
2.1.3 主要试剂
2.1.4 主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 病毒分离与前病毒 DNA 提取
2.2.2 病毒基因克隆与测序
2.2.3 DNA 序列比对及进化树分析
2.3 实验结果
2.3.1 ALV-J 的病毒分离及鉴定
2.3.2 ALV-J env 基因的遗传演化分析
2.3.3 ALV-J U3 的进化分析
2.3.4 ALV-J 3’UTR 的进化分析
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 3’UTR 205nt 缺失增强 ALV-J 致病性
3.1 实验材料
3.1.1 载体、菌株和细胞
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.2 实验方法
3.2.1 ALV-J 感染性克隆构建策略
3.2.2 病毒拯救和鉴定
3.2.3 拯救病毒的体外复制动力学
3.2.4 p27 蛋白表达和反转录酶活性鉴定
3.2.5 亚病毒基因组构建
3.2.6 亚病毒基因组中 p27 蛋白的表达和未剪切 RNA 的核质穿梭
3.2.7 拯救病毒的体内致病性
3.2.8 数据分析
3.3 实验结果
3.3.1 拯救缺失 205nt 和嵌合 205nt 的两株 ALV-J 病毒
3.3.2 205nt 缺失增强 ALV-J 在血管内皮细胞中的复制
3.3.3 205nt 缺失促进 ALV-J 未剪切 RNA 从细胞核输出到细胞质
3.3.4 205nt 缺失增强 ALV-J 在体内的复制
3.3.5 205nt 缺失增强 ALV-J 致瘤性和致死率
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 ALV-J 致病性增强的分子机制
4.1 实验材料
4.1.1 载体、菌株和细胞
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器
4.2 实验方法
4.2.1 VEGF-A 和 VEGFR-2 表达
4.2.2 ALV-J 病毒载量及其插入位点的鉴定
4.2.3 p21WAF1的表达和 p53 表达载体的构建
4.2.4 DF-1 原型 p53 蛋白和突变型 p53 蛋白的细胞定位
4.2.5 U3 介导的报告基因载体和亚病毒基因组构建
4.2.6 亚病毒基因组中 p27 蛋白的表达和未剪切 RNA 的核质穿梭
4.2.7 染色体免疫共沉淀（CHIP）验证 p53 蛋白与 ALV-J U3 互作
4.2.8 凝胶阻滞试验（EMSA）验证 p53 蛋白与 U3 互作作用域
4.2.9 数据分析
4.3 实验结果
4.3.1 ALV-J 致瘤组织中 VEGF-A 及其受体 VEGFR-2 高水平表达
4.3.2 VEGF-A 和 VEGFR-2 表达水平与 ALV-J 复制呈正相关
4.3.3 ALV-J 持续感染致 TP53 基因突变
4.3.4 DF-1 细胞中原型 p53 蛋白抑制 ALV-J U3 活性
4.3.5 突变型 p53 蛋白失去对抑制 ALV-J 复制的作用
4.3.6 ALV-J 感染 DF-1 细胞增加 DF-1 原型 p53 蛋白表达
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 宿主 miRNAs 在 ALV-J 致病过程中的作用
5.1 实验材料
5.1.1 载体、菌株，毒株和细胞
5.1.2 主要试剂
5.1.3 主要仪器
5.2 实验方法
5.2.1 预测 ALV-J 基因组编码 miRNAs 的预测
5.2.2 预测 ALV-J 编码 miRNAs 前体分子的验证
5.2.3 原型及突变型报告基因的构建和检测
5.2.4 预测 miRNA 与靶标的结合
5.2.5 宿主 miRNAs 抑制子和表达载体的构建
5.2.6 宿主 miRNAs 的 Northern Blot 验证
5.2.7 原型 ALV-J 和突变型 ALV-J 的拯救
5.2.8 ALV-J p27 蛋白的表达及病毒复制
5.2.9 宿主 gga-miR-1650 茎环法荧光定量 PCR 检测
5.2.10 数据分析
5.3 实验结果
5.3.1 ALV-J 基因组中 miRNAs 前体分子预测
5.3.2 Northern Blot 检测不到预测的 ALV-J 编码的前体分子
5.3.3 DF-1 细胞中可能存在 miRNAs 调控 ALV-J 5’UTR 介导的报告基因活性
5.3.4 gga-miR-1650 调控 5’UTR 介导的报告基因活性
5.3.5 ALV-J 5’UTR 是 gga-miR-1650 的靶标
5.3.6 过表达 gga-miR-1650 抑制 ALV-J 蛋白表达和病毒复制
5.3.7 ALV-J 感染引起细胞 gga-miR-1650 表达上调
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查[J]. 高玉龙,邵华斌,罗青平,潘伟,秦立廷,孙芬芬,刘超男,高宏雷,祁小乐,王笑梅. 中国预防兽医学报. 2010(01)
[2]中国麻鸡中发现禽J亚群白血病[J]. 成子强,张利,刘思当,张玲娟,崔治中. 微生物学报. 2005(04)
[3]突变型抑癌基因p53在蛋鸡J亚群禽白血病中的表达[J]. 徐镔蕊,董卫星,何召庆,余春明,李宁,冯小宇,L.F.Lee,Maoxiang Li. 农业生物技术学报. 2003(03)
博士论文
[1]蛋鸡ALV-J的分离鉴定及分子致瘤机制的研究[D]. 曲悦.山东农业大学 2012
本文编号：2975236
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/2975236.html
