利用特定转录因子的mRNA诱导获得山羊iPS细胞的研究
发布时间：2021-01-16 06:12
体细胞中导入特定的多能性转录因子可以将体细胞重编程为诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells, iPS）。截止到目前,已成功的获得人、牛、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、猴、兔、猪等物种的iPS细胞。iPS细胞具有和胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ESC）类似的多能性等特性,该技术对于难以建立胚胎干细胞系的动物无疑提供了一种可行的替代方案。但是,最初建立iPS细胞的传统方法是利用病毒载体将特定诱导因子Oct4、Sox2、Klf4和c-myc转入体细胞内,病毒的转染效率不能达到100%,获得4个诱导因子同时表达的细胞比例很低,且病毒载体会随机插入到体细胞的基因组中,可能导致正常基因的表达受到影响,或引起基因突变并激活原癌基因的表达。质粒载体、多蛋白表达系统、化学小分子以及转座系统虽然尽可能地减少了外源基因和病毒元件的整合,使获得iPS细胞的安全性获得提高,但由于操作复杂、分析困难、制备效率低等原因制约着iPS细胞制备技术的发展。相比于以上制备iPS细胞技术,mRNA诱导技术在理论上存在优势：一方面避开了外源基因插入体细胞基因组的风险；...
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
符号表
前言
第一章 iPS细胞的研究进展
1 前言
2 iPS细胞诱导技术概述
2.1 采用基因插入不可删除型运载系统诱导
2.2 采用基因插入可删除型运载系统诱导
2.3 采用无基因插入型运载系统诱导
2.4 采用无核酸参与型运载系统诱导
3 iPS细胞诱导培养体系概述
3.1 目的细胞的选择
3.2 诱导培养条件
3.2.1 外源多能性转录因子的导入
3.2.2 诱导过程中目的细胞的培养
3.2.3 iPS细胞的传代培养
3.3 iPS细胞的表观遗传学检测
3.3.1 分子水平
3.3.2 细胞水平
3.3.3 动物水平
4 iPS细胞的应用前景
4.1 构建动物模型
4.2 建立疾病模型
4.3 新药发现及筛选
4.4 转基因动物研究
第二章 山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因克隆
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种和质粒来源
1.1.2 引物、工具酶及试剂
1.1.3 其他常用试剂配制
1.2 方法
1.2.1 山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因克隆及鉴定
1.2.1.1 山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织总RNA提取
1.2.1.2 山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因cDNA的扩增
1.2.1.3 感受态细胞的制备及转化
1.2.1.4 菌液PCR扩增目的基因
1.2.1.5 质粒DNA的提取
1.2.1.6 去除内毒素
1.2.1.7 酶切鉴定
1.2.2 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列测定及同源性分析
2 结果与分析
2.1 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的克隆
2.2 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列测定及同源性分析
3 讨论
第三章 真核表达载体构建及转录因子体外转录
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
1.1.2 引物、工具酶及试剂
1.1.3 其他常用试剂配制
1.2 方法
1.2.1 真核表达载体构建
1.2.2 转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的体外转录
1.2.2.1 质粒纯化
1.2.2.2 mRNA“加帽”
1.2.2.3 mRNA“加尾”
1.2.2.4 mRNA纯化
2 结果与分析
2.1 真核表达载体构建
2.2 转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的体外转录
3. 讨论
第四章 山羊iPS细胞诱导及培养体系的优化
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
1.1.2 试剂
1.2 方法
1.2.1 GEF细胞及MEF细胞的分离培养
1.2.2 饲养层的制备
1.2.3 培养液的配制
1.2.4 山羊iPS细胞的获取与培养
1.2.5 山羊iPS细胞的传代、冻存与复苏
1.2.6 山羊iPS细胞的鉴定
1.2.6.1 形态观察
1.2.6.2 AP染色
1.2.6.3 免疫荧光检测
2 结果与分析
2.1 GEF细胞和MEF细胞形态
2.2 mRNA诱导山羊体细胞重编程成iPS细胞
2.3 不同培养体系对山羊体细胞重编程的影响
2.4 不同培养体系对山羊iPS细胞生长的影响
2.5 最佳培养体系山羊iPS细胞干性检测
2.5.1 AP染色鉴定
2.5.2 免疫荧光检测
3. 讨论
第五章 山羊iPS细胞生物学特性及重编程机制研究
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
1.1.2 试剂及引物
1.2 方法
1.2.1 GEF细胞及MEF细胞的分离培养
1.2.2 饲养层的制备
1.2.3 培养液的配制
1.2.4 山羊iPS细胞的获取与培养
1.2.5 山羊iPS细胞的传代、冻存与复苏
1.2.6 山羊iPS细胞生物学特性鉴定
1.2.6.1 形态观察
1.2.6.2 AP染色
1.2.6.3 免疫荧光检测
1.2.6.4 类胚体的制作
1.2.6.5 RT-PCR和qRT-PCR检测
1.2.6.6 Western blot分析
1.2.6.7 山羊iPS细胞的自发分化
1.2.6.8 核型分析
2 结果与分析
2.1 利用mRNA体系诱导获得山羊iPS细胞
2.2 山羊iPS细胞具有典型的ES细胞形态和特异性标记物的表达
2.3 诱导过程中的重编程机制
2.4 山羊iPS细胞的表观遗传状态
2.5 山羊iPS细胞具有在体外形成三种胚层细胞的能力
3. 讨论
全文结论
参考文献
附录
致谢
硕士期间发表的论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]昆明小鼠胚胎干细胞培养体系的优化[J]. 任卫青,张志平,许晓婷,邓立新,李小佳,吕婧玉,翟明胜,王新庄. 畜牧兽医学报. 2013(02)
[2]猪CatSperB和CatSperG基因的克隆、表达及生物信息学[J]. 宋成义,周家庆,冯晓军,谢雨琇,李庆平,吴晗,高波,王霄燕. 中国农业科学. 2012(21)
[3]猪L-Myc基因的分子克隆及在细胞重编程中的应用[J]. 李珍珍,崔怡,高祎,成德,刘亚军,王华岩. 中国农业科学. 2012(17)
[4]利用piggyBac载体制备小鼠诱导性多能干细胞[J]. 张金吨,赵丽霞,吴宝江,李云霞,张静南,苏杰,孙伟,戴雁峰,郭继彤,胡树香,李瑶,汪玮,刘鹏涛,李喜和. 中国科学:生命科学. 2012(07)
[5]一种获得猪诱导性多能干细胞的新方法[J]. 阮卫民,韩建永,李品,曹素英,安杨,林宾,李宁. 中国科学:生命科学. 2011(05)
[6]阿拉伯马染色体G带核型分析[J]. 张静南,刘永斌,张金吨,苏杰,李云霞,孙伟,赵丽霞,郭继彤,李喜和. 华北农学报. 2011(02)
[7]饲养层和生长因子对山羊类胚胎干细胞的影响[J]. 崔雯,熊浩,王杏龙. 中国畜牧杂志. 2011(01)
[8]以两种不同成纤维细胞为饲养层培养牛胚胎干细胞的比较[J]. 靳木子,马玉珍,仓明,王瑞,任宇,刘东军. 畜牧与兽医. 2010(06)
[9]无血清分离昆明系小鼠胚胎干细胞[J]. 余树民,严兴荣,陈冬梅,王晗,窦忠英. 中国兽医学报. 2008(03)
[10]小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态[J]. 李斌,彭秋平,卢伟英,徐雯,金应霞,黄元华. 中国组织工程研究与临床康复. 2008(03)
本文编号：2980302
【文章来源】：扬州大学江苏省
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
符号表
前言
第一章 iPS细胞的研究进展
1 前言
2 iPS细胞诱导技术概述
2.1 采用基因插入不可删除型运载系统诱导
2.2 采用基因插入可删除型运载系统诱导
2.3 采用无基因插入型运载系统诱导
2.4 采用无核酸参与型运载系统诱导
3 iPS细胞诱导培养体系概述
3.1 目的细胞的选择
3.2 诱导培养条件
3.2.1 外源多能性转录因子的导入
3.2.2 诱导过程中目的细胞的培养
3.2.3 iPS细胞的传代培养
3.3 iPS细胞的表观遗传学检测
3.3.1 分子水平
3.3.2 细胞水平
3.3.3 动物水平
4 iPS细胞的应用前景
4.1 构建动物模型
4.2 建立疾病模型
4.3 新药发现及筛选
4.4 转基因动物研究
第二章 山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因克隆
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种和质粒来源
1.1.2 引物、工具酶及试剂
1.1.3 其他常用试剂配制
1.2 方法
1.2.1 山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因克隆及鉴定
1.2.1.1 山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织总RNA提取
1.2.1.2 山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因cDNA的扩增
1.2.1.3 感受态细胞的制备及转化
1.2.1.4 菌液PCR扩增目的基因
1.2.1.5 质粒DNA的提取
1.2.1.6 去除内毒素
1.2.1.7 酶切鉴定
1.2.2 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列测定及同源性分析
2 结果与分析
2.1 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的克隆
2.2 Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列测定及同源性分析
3 讨论
第三章 真核表达载体构建及转录因子体外转录
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
1.1.2 引物、工具酶及试剂
1.1.3 其他常用试剂配制
1.2 方法
1.2.1 真核表达载体构建
1.2.2 转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的体外转录
1.2.2.1 质粒纯化
1.2.2.2 mRNA“加帽”
1.2.2.3 mRNA“加尾”
1.2.2.4 mRNA纯化
2 结果与分析
2.1 真核表达载体构建
2.2 转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的体外转录
3. 讨论
第四章 山羊iPS细胞诱导及培养体系的优化
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
1.1.2 试剂
1.2 方法
1.2.1 GEF细胞及MEF细胞的分离培养
1.2.2 饲养层的制备
1.2.3 培养液的配制
1.2.4 山羊iPS细胞的获取与培养
1.2.5 山羊iPS细胞的传代、冻存与复苏
1.2.6 山羊iPS细胞的鉴定
1.2.6.1 形态观察
1.2.6.2 AP染色
1.2.6.3 免疫荧光检测
2 结果与分析
2.1 GEF细胞和MEF细胞形态
2.2 mRNA诱导山羊体细胞重编程成iPS细胞
2.3 不同培养体系对山羊体细胞重编程的影响
2.4 不同培养体系对山羊iPS细胞生长的影响
2.5 最佳培养体系山羊iPS细胞干性检测
2.5.1 AP染色鉴定
2.5.2 免疫荧光检测
3. 讨论
第五章 山羊iPS细胞生物学特性及重编程机制研究
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
1.1.2 试剂及引物
1.2 方法
1.2.1 GEF细胞及MEF细胞的分离培养
1.2.2 饲养层的制备
1.2.3 培养液的配制
1.2.4 山羊iPS细胞的获取与培养
1.2.5 山羊iPS细胞的传代、冻存与复苏
1.2.6 山羊iPS细胞生物学特性鉴定
1.2.6.1 形态观察
1.2.6.2 AP染色
1.2.6.3 免疫荧光检测
1.2.6.4 类胚体的制作
1.2.6.5 RT-PCR和qRT-PCR检测
1.2.6.6 Western blot分析
1.2.6.7 山羊iPS细胞的自发分化
1.2.6.8 核型分析
2 结果与分析
2.1 利用mRNA体系诱导获得山羊iPS细胞
2.2 山羊iPS细胞具有典型的ES细胞形态和特异性标记物的表达
2.3 诱导过程中的重编程机制
2.4 山羊iPS细胞的表观遗传状态
2.5 山羊iPS细胞具有在体外形成三种胚层细胞的能力
3. 讨论
全文结论
参考文献
附录
致谢
硕士期间发表的论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]昆明小鼠胚胎干细胞培养体系的优化[J]. 任卫青,张志平,许晓婷,邓立新,李小佳,吕婧玉,翟明胜,王新庄. 畜牧兽医学报. 2013(02)
[2]猪CatSperB和CatSperG基因的克隆、表达及生物信息学[J]. 宋成义,周家庆,冯晓军,谢雨琇,李庆平,吴晗,高波,王霄燕. 中国农业科学. 2012(21)
[3]猪L-Myc基因的分子克隆及在细胞重编程中的应用[J]. 李珍珍,崔怡,高祎,成德,刘亚军,王华岩. 中国农业科学. 2012(17)
[4]利用piggyBac载体制备小鼠诱导性多能干细胞[J]. 张金吨,赵丽霞,吴宝江,李云霞,张静南,苏杰,孙伟,戴雁峰,郭继彤,胡树香,李瑶,汪玮,刘鹏涛,李喜和. 中国科学:生命科学. 2012(07)
[5]一种获得猪诱导性多能干细胞的新方法[J]. 阮卫民,韩建永,李品,曹素英,安杨,林宾,李宁. 中国科学:生命科学. 2011(05)
[6]阿拉伯马染色体G带核型分析[J]. 张静南,刘永斌,张金吨,苏杰,李云霞,孙伟,赵丽霞,郭继彤,李喜和. 华北农学报. 2011(02)
[7]饲养层和生长因子对山羊类胚胎干细胞的影响[J]. 崔雯,熊浩,王杏龙. 中国畜牧杂志. 2011(01)
[8]以两种不同成纤维细胞为饲养层培养牛胚胎干细胞的比较[J]. 靳木子,马玉珍,仓明,王瑞,任宇,刘东军. 畜牧与兽医. 2010(06)
[9]无血清分离昆明系小鼠胚胎干细胞[J]. 余树民,严兴荣,陈冬梅,王晗,窦忠英. 中国兽医学报. 2008(03)
[10]小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态[J]. 李斌,彭秋平,卢伟英,徐雯,金应霞,黄元华. 中国组织工程研究与临床康复. 2008(03)
本文编号：2980302
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