猪亲环素A的原核表达及其对猪传染性胃肠炎病毒体外复制的影响
发布时间：2021-01-16 10:47
动物病毒感染、复制以及致病等过程都离不开宿主细胞的蛋白质参与,宿主细胞的蛋白质可能在病毒感染过程中抑制病毒的生命活动,限制甚至清除病毒感染,也可能被病毒利用,为病毒的繁殖等提供便利。亲环素A （CypA）是一种保守性极强的伴侣蛋白,广泛分布于动物与微生物体内,哺乳动物的亲环素A大多与疾病相关。本实验旨在探索猪CypA在猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）复制过程中的作用,就猪CypA对TGEV体外复制的影响进行以下研究：1.TGEV四川株的分离鉴定与荧光定量RT-PCR检测方法的建立利用PK-15细胞从四川腹泻仔猪样品中分离得到一株病毒,经PCR检测、病毒理化实验与微量中和实验证实该分离株为TGEV,命名为SC-T。根据TGEV的S基因设计合成一对荧光定量RT-PCR检测引物,建立TGEV SYBR Green荧光定量RT-PCR检测方法。构建标准品质粒绘制荧光定量标准曲线,并进行该检测方法的特异性、重复性、灵敏性实验。标准品质粒浓度在5.32×107～5.32×101copies/μL时可以得到较理想的标准曲线,该方法重复性与特异性好,可检测最低浓度为5copies/μL。2.猪CypA的...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一部分 文献综述
1 猪传染性胃肠炎研究进展
1.1 病原学
1.2 猪传染性胃肠炎流行病学
1.3 猪传染性胃肠炎致病机制
1.4 猪传染性胃肠炎诊断
1.4.1 病毒的分离与鉴定
1.4.2 血清学检测
1.4.3 猪传染性胃肠炎病毒分子检测
1.5 猪传染性胃肠炎疫苗与免疫预防
2 亲环素A研究进展
2.1 亲环素A的结构与生物学功能
2.2 亲环素A在病毒感染中的作用
2.2.1 CypA与艾滋病毒的相互作用
2.2.2 Cyclophilin A与流感病毒的相互作用
2.2.3 Cyclophilin A与其他病毒的相互作用
目的与意义
第二部分 实验部分
第一章 猪传染性胃肠炎病毒分离鉴定与荧光定量RT-PCR检测方法的建立
1 实验材料
1.1 实验试剂
1.2 菌株与细胞
1.3 实验器材
2 实验方法
2.1 病毒分离
2.2 病毒PCR检测
2.2.1 病毒液总RNA提取
2.2.2 反转录制备cDNA
2.2.3 TGEV PCR检测
2.2.4 其他病毒病原PCR检测
2.3 病毒TCID50测定
2.4 病毒中和实验
2.5 病毒理化性质实验
2.5.1 病毒核酸类型测定
2.5.2 氯仿实验
2.6 猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
2.6.1 荧光定量RT-PCR检测引物设计
2.6.2 标准质粒的构建
2.6.3 TGEV荧光定量RT-PCR标准曲线绘制
2.6.4 特异性、灵敏性、重复性实验
3 实验结果
3.1 病毒培养
3.2 病毒PCR检测
3.3 病毒TCID50
3.4 病毒中和实验
3.5 病毒理化实验
3.5.1 病毒核酸类型
3.5.2 氯仿实验
3.6 TGEV荧光定量检测方法
3.6.1 标准品质粒的构建
3.6.2 TGEV荧光定量RT-PCR标准曲线绘制
3.6.3 特异性、灵敏性、重复性实验
4 讨论
4.1 关于TGEV病毒分离鉴定
4.2 关于TGEV荧光定量RT-PCR检测方法的建立
第二章 猪亲环素A的克隆与原核表达
1 材料与试剂
1.1 实验试剂
1.2 菌株与细胞
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 猪CypA基因PCR扩增
2.1.1 引物设计
2.1.2 猪外周血淋巴细胞的分离
2.1.3 不同细胞总RNA的提取
2.1.4 RT-PCR扩增
2.2 猪CypA基因的克隆测序与序列分析
2.3 猪CypA原核表达载体pET30-CypA的构建
2.3.1 酶切消化与DNA回收
2.3.2 连接转化与阳性克隆筛选
2.3.3 猪CypA基因原核表达菌株的构建
2.4 pET30-CypA原核表达菌的培养与表达
2.5 原核表达条件的优化
2.6 重组表达蛋白的可溶性检测
2.7 猪CypA蛋白的大量表达与纯化
2.8 猪CypA融合表达蛋白Westernblot鉴定
3 实验结果
3.1 猪CypA基因PCR扩增
3.2 猪CypA基因遗传进化分析
3.3 猪CypA原核表达载体构建结果
3.4 pET30-CypA原核表达菌的培养与表达
3.5 pET30-CypA原核表达条件优化
3.6 重组表达蛋白的可溶性检测
3.7 猪CypA蛋白的大量表达与纯化
3.8 猪CypA蛋白Westernblot鉴定
4 讨论
4.1 关于猪CypA蛋白克隆测序与原核表达
4.3 关于CypA蛋白的鉴定与纯化
第三章 亲环素A对猪传染性胃肠炎病毒体外复制的影响
1 实验材料
1.1 实验试剂
1.2 毒株与细胞
1.3 实验器材
2 实验方法
2.1 猪CypA蛋白表达纯化与透析
2.2 猪CypA蛋白浓度与纯度检测
2.3 猪CypA蛋白对TGEV复制的影响
2.3.1 分组处理
2.3.2 荧光定量RT-PCR检测不同样品中TGEV含量
3 实验结果
3.1 猪CypA蛋白纯化与透析
3.2 猪CypA蛋白浓度与纯度检测
3.3 猪CypA蛋白对TGEV一步生长曲线的影响
4 讨论
4.1 关于TGEV一步生长曲线的测定
4.2 关于猪CypA对TGEV体外复制影响的初步探索
结论
参考文献
致谢
附表
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]仔猪人工感染猪传染性胃肠炎病毒的病理分析[J]. 王龙涛,葛晨霞,黄海龙,胡桂学,高丰. 安徽农业科学. 2010(28)
[2]CypA的生物学功能及其与肺癌相关的研究进展[J]. 钱哲,岳文涛,李宝兰. 中国肺癌杂志. 2010(08)
[3]猪传染性胃肠炎的防控[J]. 赵永乐,曾春琳,梁志松,曾文娟. 畜牧与饲料科学. 2009(10)
[4]亲环素的研究进展与展望[J]. 潘克厚,马晓磊,石娟. 中国海洋大学学报(自然科学版). 2008(03)
[5]猪传染性胃肠炎病毒S基因核酸疫苗免疫小鼠体液免疫功能变化的研究[J]. 任玲,李广兴,张宏伟. 畜牧兽医杂志. 2007(05)
[6]猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白抗原间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 孙东波,冯力,时洪艳,刘胜旺,陈洪岩,佟有恩,李伟杰,王明,马思奇,陈建飞. 中国预防兽医学报. 2006(05)
[7]应用多重RT-PCR方法检测158例猪粪样中的两种冠状病毒[J]. 杨群,何孔旺,陆承平. 中国预防兽医学报. 2006(04)
[8]猪传染性胃肠炎病毒分子生物学研究进展[J]. 李建强,柳纪省,胡永浩,程杰,兰喜,殷相平,李宝玉,李志勇,杨彬,马友记. 动物医学进展. 2006(02)
[9]多重RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒[J]. 陈芳,刘惠莉,孙红立,曹祥荣,李震,赵立平. 中国兽医学报. 2005(01)
[10]实时荧光定量PCR技术及其应用[J]. 欧阳松应,杨冬,欧阳红生,马鹤雯. 生命的化学. 2004(01)
本文编号：2980689
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一部分 文献综述
1 猪传染性胃肠炎研究进展
1.1 病原学
1.2 猪传染性胃肠炎流行病学
1.3 猪传染性胃肠炎致病机制
1.4 猪传染性胃肠炎诊断
1.4.1 病毒的分离与鉴定
1.4.2 血清学检测
1.4.3 猪传染性胃肠炎病毒分子检测
1.5 猪传染性胃肠炎疫苗与免疫预防
2 亲环素A研究进展
2.1 亲环素A的结构与生物学功能
2.2 亲环素A在病毒感染中的作用
2.2.1 CypA与艾滋病毒的相互作用
2.2.2 Cyclophilin A与流感病毒的相互作用
2.2.3 Cyclophilin A与其他病毒的相互作用
目的与意义
第二部分 实验部分
第一章 猪传染性胃肠炎病毒分离鉴定与荧光定量RT-PCR检测方法的建立
1 实验材料
1.1 实验试剂
1.2 菌株与细胞
1.3 实验器材
2 实验方法
2.1 病毒分离
2.2 病毒PCR检测
2.2.1 病毒液总RNA提取
2.2.2 反转录制备cDNA
2.2.3 TGEV PCR检测
2.2.4 其他病毒病原PCR检测
2.3 病毒TCID50测定
2.4 病毒中和实验
2.5 病毒理化性质实验
2.5.1 病毒核酸类型测定
2.5.2 氯仿实验
2.6 猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
2.6.1 荧光定量RT-PCR检测引物设计
2.6.2 标准质粒的构建
2.6.3 TGEV荧光定量RT-PCR标准曲线绘制
2.6.4 特异性、灵敏性、重复性实验
3 实验结果
3.1 病毒培养
3.2 病毒PCR检测
3.3 病毒TCID50
3.4 病毒中和实验
3.5 病毒理化实验
3.5.1 病毒核酸类型
3.5.2 氯仿实验
3.6 TGEV荧光定量检测方法
3.6.1 标准品质粒的构建
3.6.2 TGEV荧光定量RT-PCR标准曲线绘制
3.6.3 特异性、灵敏性、重复性实验
4 讨论
4.1 关于TGEV病毒分离鉴定
4.2 关于TGEV荧光定量RT-PCR检测方法的建立
第二章 猪亲环素A的克隆与原核表达
1 材料与试剂
1.1 实验试剂
1.2 菌株与细胞
1.3 实验仪器
2 实验方法
2.1 猪CypA基因PCR扩增
2.1.1 引物设计
2.1.2 猪外周血淋巴细胞的分离
2.1.3 不同细胞总RNA的提取
2.1.4 RT-PCR扩增
2.2 猪CypA基因的克隆测序与序列分析
2.3 猪CypA原核表达载体pET30-CypA的构建
2.3.1 酶切消化与DNA回收
2.3.2 连接转化与阳性克隆筛选
2.3.3 猪CypA基因原核表达菌株的构建
2.4 pET30-CypA原核表达菌的培养与表达
2.5 原核表达条件的优化
2.6 重组表达蛋白的可溶性检测
2.7 猪CypA蛋白的大量表达与纯化
2.8 猪CypA融合表达蛋白Westernblot鉴定
3 实验结果
3.1 猪CypA基因PCR扩增
3.2 猪CypA基因遗传进化分析
3.3 猪CypA原核表达载体构建结果
3.4 pET30-CypA原核表达菌的培养与表达
3.5 pET30-CypA原核表达条件优化
3.6 重组表达蛋白的可溶性检测
3.7 猪CypA蛋白的大量表达与纯化
3.8 猪CypA蛋白Westernblot鉴定
4 讨论
4.1 关于猪CypA蛋白克隆测序与原核表达
4.3 关于CypA蛋白的鉴定与纯化
第三章 亲环素A对猪传染性胃肠炎病毒体外复制的影响
1 实验材料
1.1 实验试剂
1.2 毒株与细胞
1.3 实验器材
2 实验方法
2.1 猪CypA蛋白表达纯化与透析
2.2 猪CypA蛋白浓度与纯度检测
2.3 猪CypA蛋白对TGEV复制的影响
2.3.1 分组处理
2.3.2 荧光定量RT-PCR检测不同样品中TGEV含量
3 实验结果
3.1 猪CypA蛋白纯化与透析
3.2 猪CypA蛋白浓度与纯度检测
3.3 猪CypA蛋白对TGEV一步生长曲线的影响
4 讨论
4.1 关于TGEV一步生长曲线的测定
4.2 关于猪CypA对TGEV体外复制影响的初步探索
结论
参考文献
致谢
附表
攻读硕士学位期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]仔猪人工感染猪传染性胃肠炎病毒的病理分析[J]. 王龙涛,葛晨霞,黄海龙,胡桂学,高丰. 安徽农业科学. 2010(28)
[2]CypA的生物学功能及其与肺癌相关的研究进展[J]. 钱哲,岳文涛,李宝兰. 中国肺癌杂志. 2010(08)
[3]猪传染性胃肠炎的防控[J]. 赵永乐,曾春琳,梁志松,曾文娟. 畜牧与饲料科学. 2009(10)
[4]亲环素的研究进展与展望[J]. 潘克厚,马晓磊,石娟. 中国海洋大学学报(自然科学版). 2008(03)
[5]猪传染性胃肠炎病毒S基因核酸疫苗免疫小鼠体液免疫功能变化的研究[J]. 任玲,李广兴,张宏伟. 畜牧兽医杂志. 2007(05)
[6]猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白抗原间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 孙东波,冯力,时洪艳,刘胜旺,陈洪岩,佟有恩,李伟杰,王明,马思奇,陈建飞. 中国预防兽医学报. 2006(05)
[7]应用多重RT-PCR方法检测158例猪粪样中的两种冠状病毒[J]. 杨群,何孔旺,陆承平. 中国预防兽医学报. 2006(04)
[8]猪传染性胃肠炎病毒分子生物学研究进展[J]. 李建强,柳纪省,胡永浩,程杰,兰喜,殷相平,李宝玉,李志勇,杨彬,马友记. 动物医学进展. 2006(02)
[9]多重RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒[J]. 陈芳,刘惠莉,孙红立,曹祥荣,李震,赵立平. 中国兽医学报. 2005(01)
[10]实时荧光定量PCR技术及其应用[J]. 欧阳松应,杨冬,欧阳红生,马鹤雯. 生命的化学. 2004(01)
本文编号：2980689
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