弓形虫致密颗粒蛋白1（GRA1）的生物学功能研究

发布时间：2021-01-17 06:05

　　刚地弓形虫是一类严格的胞內寄生原虫,呈全世界分布,可感染哺乳动物,鸟类,甚至冷血动物,弓形虫有如此广泛的宿主,除了与它强大的入侵机制有关之外,还和它强大的免疫逃避机制和适应并改变宿主细胞环境的能力有着密切的关系。这也是导致弓形虫病难以防控的主要原因。弓形虫致密颗粒蛋白GRA16、GRA24、TgIST可利用宿主细胞信号通路进入宿主细胞核,调控宿主细胞表达,改变宿主细胞的免疫状态和细胞内环境,以实现免疫逃避和长期寄生。致密颗粒蛋白GRA17和GRA23可在纳虫泡膜上形成微孔,该孔可帮助弓形虫摄取宿主营养,致密颗粒蛋白MAF1、GRA3和GRA5参与弓形虫对宿主细胞线粒体和内质网的招募,帮助弓形虫利用宿主营养。可以说,致密颗粒蛋白对于弓形虫胞內寄生十分重要。GRA1是第一个被发现的致密颗粒蛋白,但关于它的生物学功能我们知之甚少,研究它的生物学功能可以为进一步理解弓形虫胞內寄生的特性提供帮助,为以后的弓形虫研究奠定理论基础。本研究以弓形虫致密颗粒蛋白1（TgGRA1）为研究对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和四环素调控系统（Tet-off）对TATi虫株中的GRA1进行条件性敲除,... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

弓形虫生活史[49]

图 1-2 BioID 技术模式图[83]Fig.1-2 Model for application of BioID method[83]术的特点是对真核细胞自然环境中对目标蛋白的邻近蛋白进行而这些邻近蛋白很有可能就是与目标蛋白有潜在性互作的蛋白，对筛选到的邻近蛋白进行定性分析[83]。BirA*是由BirA突变而来于大肠杆菌的具有35kDa大小的DNA结合生物素蛋白连接酶。它辅酶A羧化酶的生物素化，同时也作为一个转录抑制子生物素合。但是BirA的生物素化范围具有极高的特异性，能够被其识别并须拥有一个生物素受体标签(BAT)[83]。为了提高BirA的生物素化序列中的118位精氨酸突变为甘氨酸，如此，BirA*突变体的生物高[83]。素标记技术的应用组装的精确特征描述是理解功能性蛋白质网络的先决条件，Bio用于解决这个问题[82]。BioID 已经成功的筛选到哺乳动物核纤层胞骨架结构[84]，一些联系紧密的亚细胞蛋白组[85]，还发现了一种

弓形虫致密颗粒蛋白 1（GRA1）的生物学功能研究m 电转杯中按 1:5 比例加入同源片段和 CRISPR 质粒，混1) 中的虫体悬液加入电转杯中，混匀进行转化，转化条 μF，50 Ω，电击 2~3 次，电转后的虫体在 HFF 细胞中未经电转处理的虫体作为对照组；4 小时之后对实验组和对照组进行换液，加入含有霉酚度分别为 25 ug/ml、50 ug/ml 的培养基，药物筛选 2~30%虫体逸出，细胞内纳虫泡比较大，按照 3.3.1 的方法中培养基需加入霉酚酸和黄嘌呤，直至空白对照的虫体制稀释法在长满 HFF 细胞的 96 孔板中进行单克隆筛筛选获得的单克隆接种到长满 HFF 细胞的 24 孔板中 PCRs 对所有单克隆进行初步鉴定。初步鉴定正确的 T25 中继续扩大培养，进行再鉴定，最终鉴定正确的虫鉴定 PCRs 包括 PCR1、PCR2、PCR3，鉴定方法及鉴


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