CD49f和miR-302对奶山羊雄性生殖干细胞体外培养生物学特性的影响

发布时间：2021-01-19 21:40

　　奶山羊是重要的经济动物，具有生产肉、奶等经济价值，利用奶山羊乳腺作为生物反应器生产生物药制品具有巨大的应用前景。采用雄性生殖干细胞作为种子细胞开展奶山羊的遗传育种以及转基因的研究是目前的研究热点。雄性生殖干细胞负责成年雄性个体的精子生产；在体外适宜培养条件下，其可形成类似胚胎干细胞样的多能干细胞。CD49f已经被证实是人和小鼠雄性生殖干细胞的有效标记，与细胞的多能性关系密切。miR-302能调控细胞的多能性，具有重编程人体细胞至多能干细胞的潜能。一直以来，有关家畜雄性生殖干细胞体外培养形成多能干细胞的机制的研究进展较缓慢。本试验探索了CD49f作为奶山羊雄性生殖干细胞分离、鉴定标记的有效性；优化了奶山羊雄性生殖干细胞的体外培养体系；体外培养比较CD49f阴、阳性细胞的生物学功能差异；体外转导永生化基因至奶山羊雄性生殖干细胞，探索奶山羊雄性生殖干细胞永生化的可能性及其生物学特性；转导miR-302至永生化的奶山羊雄性生殖干细胞，探索miR-302对奶山羊雄性生殖干细胞生物学特性的影响；结合前人的研究结果，尝试解析CD49f和miR-302调节奶山羊mGSCs生物学特性的机制。研究结果如下... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：119 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
文献综述
    第一章 雄性生殖干细胞及 CD49f 研究进展
        1.1 雄性生殖干细胞的研究进展
            1.1.1 精原干细胞的起源
            1.1.2 生精周期
            1.1.3 生殖系发育
            1.1.4 MGSCs 的移植
            1.1.5 mGSCs 的分子标记及纯化
            1.1.6 mGSCs 微环境
            1.1.7 mGSCs 培养
            1.1.8 mGSCs 研究存在的问题
        1.2 CD49f 的研究进展
    第二章 MiR-302 及多能性干细胞研究进展
        2.1 MiR-302/367 研究进展
            2.1.1 MiR-302 的发现
            2.1.2 MiR-302 的结构
            2.1.3 MiR-302/367 在多能性细胞中的作用
            2.1.4 MiR-302/367 对体细胞重编程的作用
            2.1.5 miR-302/367 的靶基因
            2.1.6 miR-302/367 研究的前景
        2.2 多能干细胞研究进展
            2.2.1 多能性维持的核心因子
            2.2.2 多能性相关的信号通路
            2.2.3 P53
            2.2.4 多能干细胞的研究前景
试验部分
    第三章 CD49f 可以作为奶山羊 mGSCs 鉴定和富集的有效标记
        3.1 实验材料
            3.1.1 组织样品
            3.1.2 主要试剂
        3.2 方法
            3.2.1 CD49f 分子的遗传同源性分析
            3.2.2 组织切片的免疫荧光分析
            3.2.3 小鼠胚胎成纤维（Mouse embryonic fibroblast, MEF）饲养层的制备
            3.2.4 分离奶山羊睾丸单细胞悬液
            3.2.5 利用 CD49f 抗体分选奶山羊睾丸细胞
            3.2.6 分选所得细胞的后续培养
            3.2.7 细胞免疫荧光染色分析
            3.2.8 总 RNA 的提取及 PCR 检测基因表达
            3.2.9 统计分析
        3.3 结果
            3.3.1 CD49f 序列的遗传分析
            3.3.2 CD49f 在奶山羊睾丸中的定位
            3.3.3 CD49f 的表达水平及表达特异性的鉴定
            3.3.4 CD49f 分选奶山羊睾丸细胞
            3.3.5 体外培养后 CD49f 阴、阳性细胞的鉴定
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 奶山羊 mGSCs 培养条件的筛选
        4.1 材料
            4.1.1 奶山羊睾丸组织
            4.1.2 培养基配方
            4.1.3 主要试剂
        4.2 方法
            4.2.1 奶山羊 mGSCs 的分离及富集
            4.2.2 比较 N2B27 和去分化培养基培养奶山羊 mGSCs 的效果
            4.2.3 比较 N2B27 与经典的 SSC 培养基培养奶山羊 mGSCs 的效果
            4.2.4 不同细胞外基质培养奶山羊 mGSCs
            4.2.5 AP 染色
            4.2.6 其他试验方法
            4.2.7 统计分析
        4.3 结果
            4.3.1 N2B27 培养液比去分化培养液更能促进奶山羊 mGSCs 的培养
            4.3.2 N2B27 培养液与经典的 SSC 培养液培养奶山羊 mGSCs 的效果比对
            4.3.3 不同细胞外基质对奶山羊 mGSCs 体外培养的影响
            4.3.4 探索 P53 对奶山羊 mGSCs 体外无饲养层培养的影响
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章 CD49f 阴、阳性细胞体外培养的生物学特性研究
        5.1 材料
            5.1.1 奶山羊睾丸组织
            5.1.2 酶类及其他相关试剂
            5.1.3 主要仪器及耗材
        5.2 方法
            5.2.1 CD49f 阴、阳性细胞的无饲养层培养
            5.2.2 CD49f 阴、阳性细胞体外诱导形成单倍体细胞
            5.2.3 总 RNA 提取、反转录及 QPCR
            5.2.4 细胞免疫荧光染色
            5.2.5 统计分析
        5.3 结果
            5.3.1 CD49f 阴、阳性精原细胞培养于体外无饲养层条件下的差异
            5.3.2 体外诱导分化 CD49f 阴、阳性细胞形成单倍体细胞的能力检测
            5.3.3 QPCR 检测 CD49f 阴、阳性细胞的差异
            5.3.4 免疫荧光染色检测 CD49f 阴、阳性细胞的差异
        5.4 讨论
        5.5 小结
    第六章 奶山羊 mGSCs 的永生化及 miR-302 对永生化 mGSCs 的影响
        6.1 材料
            6.1.1 动物材料
            6.1.2 主要试剂
        6.2 方法
            6.2.1 分离、富集奶山羊 mGSCs
            6.2.2 慢病毒包装及奶山羊 mGSCs 的永生化
            6.2.3 细胞周期分析
            6.2.4 细胞群体倍增时间分析（Population doubling time, PDT）
            6.2.5 5-Bromo-2-deoxyuridine （BrdU）掺入分析
            6.2.6 细胞生长曲线分析
            6.2.7 永生化奶山羊 mGSCs 外源性基因分析
            6.2.8 RT-PCR
            6.2.9 免疫荧光染色
            6.2.10 永生化的奶山羊 mGSCs 体外分化能力检测
            6.2.11 永生化的奶山羊 mGSCs 的体内分化能力检测
            6.2.12 移植永生化的奶山羊 mGSCs 到生精缺陷的受体小鼠睾丸中检测其 mGSCs特性
            6.2.13 荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）检测 miR-302 及其与CD49f 与 CD90 的共定位
            6.2.14 统计分析
        6.3 结果
            6.3.1 奶山羊 mGSCs 永生化后细胞增殖能力的改变
            6.3.2 永生化前后奶山羊 mGSCs 细胞形态变化及细胞标记表达的检测
            6.3.3 永生化之后奶山羊 mGSCs 的体外分化能力检测
            6.3.4 永生化奶山羊 mGSCs 的体内分化能力检测
            6.3.5 永生化奶山羊 mGSCs 移植检测生殖干细胞功能
            6.3.6 永生化奶山羊 mGSCs 精子细胞分化功能的检测
            6.3.7 MiR-302 在奶山羊睾丸中的定位检测
            6.3.8 MiR-302 对奶山羊 mGSCs 生物学特性的影响
        6.4 讨论
        6.5 小结
    第七章 CD49f 及 miR-302 影响奶山羊 mGSCs 的机理探索
        7.1 材料
            7.1.1 细胞
            7.1.2 主要试剂
        7.2 方法
            7.2.1 PI3K 信号通路在奶山羊雄性生殖干细胞中的作用的验证
            7.2.2 CD49f 相关分子的寻找及验证
            7.2.3 Western blot
            7.2.4 miR-302 相关分子机制的解析
            7.2.5 统计分析
        7.3 结果
            7.3.1 CD49f 阳性细胞中 PI3K 信号通路的验证
            7.2.2 CD49f 影响奶山羊 mGSCs 凋亡、多能性的分子机制
            7.2.3 miR-302 影响奶山羊 mGSCs 细胞贴壁、凋亡及多能性的分子机制
        7.4 讨论
        7.5 小结
全文结论
创新之处和进一步研究的课题
参考文献
附录
附表
致谢
个人简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]12个物种miR-302基因簇的生物信息学分析[J]. 崔亚茹,张坤山,罗玉萍,李思光.  基因组学与应用生物学. 2011(03)
[2]Isolation of Subtype Spermatogonia in Juvenile Rats[J]. 白杨,叶哲伟,曾甫清.  Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences）. 2008(04)
[3]人精原干细胞的体外培养及其功能鉴定[J]. 李彦锋,郭应禄,李晓红,靳凤烁,孙中义.  中华男科学杂志. 2005(12)



本文编号：2987761