大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位单克隆抗体的制备及其B细胞线性表位分析

发布时间：2021-01-21 19:06

　　产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）是引起婴幼儿和幼畜腹泻的主要病原体之一,感染者常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡,给人类的健康和养殖业都带来了极大的危害。ETEC的主要毒力因子包括肠毒素、黏附素、志贺毒素、溶血素和内毒素等,其中引起腹泻的主要是具有宿主特异性的黏附素和肠毒素。肠毒素根据热稳定性分为不耐热肠毒素（Heat-labile toxin, LT）和耐热肠毒素（Heat-stable toxin, ST）两类,现有的检测方法分别是兔肠袢结扎试验和乳鼠灌胃试验,不利于肠毒素的快速检测。因此,开展肠毒素单克隆抗体和抗原表位的研究,对肠毒素快速检测方法的建立、致病机理研究和表位疫苗的开发具有重要的理论和实际意义。本研究以LT为研究对象,开展了LT B亚单位多克隆抗体（PAb）制备、单克隆抗体（MAb）制备和B细胞线性抗原表位的分析。抗LTB多克隆抗体的制备。本研究将质粒pET-30a-LTB转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,构建了重组大肠杆菌Rosetta/pET-30a-LTB,诱导表达后获得了重组蛋白LTB （18... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校

【文章页数】：59 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
CONTENTS
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 致病性大肠杆菌概述
        1.1.1 产志贺毒素性大肠杆菌
        1.1.2 产肠毒素性大肠杆菌
    1.2 不耐热肠毒素研究进展
        1.2.1 LT的基因与分子结构
        1.2.2 LT的理化特性和受体结合特性
        1.2.3 LT的致病机理
        1.2.4 LT的免疫原性
        1.2.5 LT的黏膜佐剂效应
        1.2.6 LT的检测方法
    1.3 LTB研究进展
        1.3.1 LTB的免疫调节作用
        1.3.2 LTB作为黏膜免疫佐剂的研究
        1.3.3 LTB单克隆抗体研究进展
        1.3.4 LTB抗原表位研究概况
    1.4 研究目的和意义
2 材料和方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株、质粒、实验动物及细胞系
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 PCR扩增引物
    2.2 实验方法
        2.2.1 重组蛋白LTB的表达及鉴定
        2.2.2 多克隆抗体的制备
        2.2.3 单克隆抗体的制备
        2.2.4 单克隆抗体亚类鉴定和效价检测
        2.2.5 单克隆抗体的免疫原性鉴定
        2.2.6 单克隆抗体的特异性试验
        2.2.7 单克隆抗体中和活性试验
        2.2.8 LTB亚单位B细胞线性抗原表位的分析
3 结果与分析
    3.1 重组蛋白LTB的表达及鉴定
        3.1.1 重组质粒pET-30a-LTB的鉴定
        3.1.2 重组蛋白LTB的诱导表达及纯化
        3.1.3 重组蛋白LTB的鉴定
    3.2 多克隆抗体的制备
    3.3 单克隆抗体的制备
        3.3.1 间接ELISA方法的建立
        3.3.2 杂交瘤细胞的筛选与鉴定
    3.4 单克隆抗体亚类鉴定和效价检测
        3.4.1 单克隆抗体亚类鉴定
        3.4.2 杂交瘤细胞上清和腹水效价检测
    3.5 单克隆抗体的免疫原性鉴定
        3.5.1 阻断ELISA
        3.5.2 Western blot鉴定
    3.6 单克隆抗体的特异性试验
        3.6.1 Western blot鉴定
        3.6.2 阻断ELISA
    3.7 单克隆抗体中和活性试验
        3.7.1 LT对Y1细胞的毒性试验
        3.7.2 LT对Y1细胞半数致死量的测定
        3.7.3 单克隆抗体中和滴度的测定
    3.8 LT B亚单位B细胞线性抗原表位的分析
        3.8.1 eltB基因分段克隆
        3.8.2 重组质粒的构建与鉴定
        3.8.3 重组短肽的表达
        3.8.4 重组短肽的鉴定
        3.8.5 LT B亚单位B细胞线性抗原表位分析
        3.8.6 单克隆抗体识别的抗原表位分析
4 讨论
    4.1 免疫原的制备
    4.2 杂交瘤细胞株建立与筛选
    4.3 杂交瘤细胞的克隆
    4.4 单克隆抗体的应用
    4.5 抗原表位的分析
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]重组大肠杆菌LTB-Stx2B蛋白的表达及其诱导小鼠体液免疫的研究[J]. 李丹丹,赵姝静,朱颖,韩林林,孟相秋,李金萍,杜元策,吕广玲,师东方.  中国动物传染病学报. 2013(05)
[2]抗大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位单克隆抗体的制备与鉴定[J]. 陈超阳,葛俊伟,姜艳平,唐丽杰,乔薪瑗,崔文,李一经.  中国预防兽医学报. 2013(04)
[3]乳酸菌融合表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白与大肠杆菌LTB及其诱导免疫应答的研究[J]. 唐丽杰,张怡婷,乔薪媛,葛俊伟,姜艳萍,崔文,李一经.  中国预防兽医学报. 2012(07)
[4]鸡传染性法氏囊病灭活疫苗免疫鸡中和抗体效价与攻毒保护力的相关关系[J]. 李林,景小冬,章振华,郑小兰,姜北宇,张建伟.  中国兽医科学. 2011(07)
[5]单克隆抗体制备技术及临床应用的研究进展[J]. 张华,胡成进.  泰山医学院学报. 2010(11)
[6]粘膜佐剂LTB优化的抗淋病ltB-nspA融合基因疫苗鼻饲免疫效果研究[J]. 王健,胡四海,戴志兵,胡耀华,张愉快,余敏君.  中国免疫学杂志. 2010(11)
[7]分泌抗体的杂交瘤细胞株的制备[J]. 贾建桃,马海智,李小进,马丽菊,陈东方,王秦秦.  昆明医学院学报. 2009(07)
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博士论文
[1]重组大肠杆菌不耐热肠毒素及其突变体以及其B亚单位的构建表达与性质研究[D]. 冯强.重庆大学 2003

硕士论文
[1]表达大肠杆菌LTAK63与LTB蛋白重组干酪乳杆菌系统的构建及其黏膜佐剂活性的评价[D]. 陈超阳.东北农业大学 2013
[2]大肠杆菌不耐热肠毒素基因的克隆、改造及表达[D]. 韩冬梅.河北农业大学 2009
[3]共表达猪细小病毒VP2与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位重组乳酸杆菌构建及其免疫学初步评价[D]. 王相清.东北农业大学 2009
[4]大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的构建及其粘膜免疫剂活性的研究与B亚单位单克隆抗体的制备[D]. 吴丽艳.扬州大学 2008
[5]大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的克隆、表达、初步纯化及免疫活性的研究[D]. 黄思扬.兰州大学 2006



本文编号：2991728