类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒FJZ03株感染性克隆的构建及鉴定

发布时间：2021-01-23 06:14

　　为构建类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）FJZ03株的感染性克隆,本研究将该株病毒全基因组分成6段,通过同义突变将其中的A14378G,引入了Mlu I酶切位点为分子标记。经RT-PCR分别扩增后,克隆至改造后的载体pSK中构建中间质粒。经测序鉴定各质粒正确后,分段连接至pSK中构建全长cDNA克隆质粒pSKFJZ03。将鉴定正确的pSK-FJZ03转染Marc-145细胞并传代,收集出现CPE后的病毒液,经RT-PCR扩增后的产物经Mlu I酶切和测序鉴定;同时采用激光共聚焦试验鉴定,获得的拯救病毒命名为RvFJZ03。分别测定RvFJZ03在Marc-145细胞与潴肺泡巨噬细胞（PAMs）中的生长曲线,比较拯救病毒与亲本病毒的生长特性。将获得的拯救病毒RvFJZ03在Marc-145细胞中连续传代,对不同代次的重组病毒分别测定病毒效价,并经RT-PCR扩增后通过Mlu I酶切和测序鉴定。测序鉴定结果表明,正确构建了感染性克隆质粒pSK-FJZ03;将其转染Marc-145细胞后并传至第3代出现典型CPE,经激光共聚焦试验、RT-PCR及测序鉴定表明拯救了重组病毒Rv... 

【文章来源】：中国预防兽医学报. 2020,42(11)北大核心

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

拯救病毒PCR产物的Mlu I酶切（A）和测序（B）鉴定结果

拯救病毒Rv FJZ03的激光共聚焦鉴定结果

拯救病毒Rv FJZ03和亲本病毒FJZ03的多步生长曲线测定结果显示，拯救病毒Rv FJZ03在Marc-145细胞和PAMs细胞中的生长曲线均与亲本病毒FJZ03相似，无明显差异（图3）。表明拯救病毒Rv FJZ03的生长特性与亲本病毒FJZ03株相一致，这为利用该拯救病毒研究该类病毒致病的分子机制奠定基础。本研究团队前期研究结果表明，类NADC30株对仔猪的致病性与NADC30相似但低于HP-PRRSV，属于中等毒力的病毒[12,17]。此外，本研究团队证实商品化的PRRS减毒活疫苗不能对FJZ03株感染的仔猪产生良好的免疫保护作用[12]。目前，人们对类NADC30株的致病机理、病毒毒力变异等问题尚不十分清楚，反向遗传技术为PRRSV的致病分子机制研究提供了非常有效的途径。因此，本研究构建带有遗传标记Mlu I酶切位点的类NADC30 FJZ03株的感染性c DNA克隆，拯救出与亲本病毒增殖特性相似的重组病毒，且其可以稳定传代，这为进一步研究该类病毒的致病机制奠定基础。

【参考文献】：
期刊论文
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[5]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定[J]. 张善瑞,周艳君,朱建平,童武,姜一峰,童光志.  中国预防兽医学报. 2011(07)



本文编号：2994710