共表达PRRSV shRNA及GP5和M蛋白的重组腺相关病毒的制备及鉴定
发布时间：2021-01-26 01:21
猪繁殖与呼吸综合征Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是一种能引起母猪流产等生殖障碍和仔猪呼吸功能障碍症状为主的高度接触性传染病。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种有囊膜的、单股正链RNA病毒。PRRS在全世界范围内广泛流行，严重危害着养猪业的发展，为预防及控制PRRSV的蔓延，急需研制出安全高效的PRRS疫苗。第一，由于现有动物疫苗接种动物后，均有一个时间长短不一的有效抗体产生期（即免疫空白期），此时动物一旦遇到病原微生物的侵袭，往往造成疫病流行；第二，疫苗接种隐性感染动物，常会引起较大副反应，甚至引起少数动物死亡；第三，分子疫苗免疫效力普遍不如常规疫苗。针对以上几个问题，本研究旨在研制具有基因治疗和免疫功能的PRRS双功能疫苗，以期在较短的时间内借助基因治疗作用，解决PRRS免疫中存在的免疫空白期感染及隐性感染等问题，并取得了以下结果：1.设计合成针对PRRSV ORF7的2条SH寡核苷酸链，退火形成带有粘性末端的SH片段，将其连接到pAAV-U6-IRES-hrGFP载体中并命名为pAAV-U6-IRES...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
rAAV-shRNA-ORF5-ORF6的构建策略Fig.2.1TheconstructionprocessofrAAV(A)SHwasinsertedtopAAV-U6-IRES-hrGFPatCMS1site;(B)Secondly,theORF5geneandORF6genewereinsertedtopAAV-U6-IRES-hrGFP-SHatCMS2site;(C)pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6,andtwohelperplasmids,
图 2.2 ORF5、ORF6 基因的扩增Fig.2.2 Electrophoresis of amplified ORF5 and ORFM: 2000 Marker; 1: ORF5 (about 630 bp); 3: ORF6 (about 520 bp); 2, 重组载体鉴定结果1 pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA 鉴定的结果体 pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA 测序结果显示 SH 片段已经插对照质粒测序结果显示 N-SH 已插入。2 pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 鉴定的结果阳性质粒以及双酶切的阳性质粒进行琼脂糖凝胶电泳。同时用质粒为模板进行的 PCR 鉴定（见图 2.3）。结合 DNA 测序结果 pAAV-U6-IRES-hrGFP 质粒上，从而双效表达重组载体U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 构建成功，并得到对照质粒V-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6。
pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 的 PCR 鉴定以及双酶tion of pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 by PCR and doF5（about 630 bp）；3：ORF6（about 520 bp）；5：pAAV-U6-IRES-h)；6：pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 (indigestion)；Marker.ORF5-ORF6 的制备病毒包装过程中病毒包装组的培养基颜色由红逐渐变黄下部分细胞变圆并聚集漂浮于培养基中，而以上现象在图 2.4)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]PCR扩增的shRNA表达盒快速筛选PRRSV有效siRNA序列[J]. 贺云霞,华荣虹,周艳君,安同庆,仇华吉,王云峰,童光志. 中国预防兽医学报. 2007(05)
[2]一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法[J]. 吴小兵,董小岩,伍志坚,屈建国,侯云德. 科学通报. 2000(19)
本文编号：3000229
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
rAAV-shRNA-ORF5-ORF6的构建策略Fig.2.1TheconstructionprocessofrAAV(A)SHwasinsertedtopAAV-U6-IRES-hrGFPatCMS1site;(B)Secondly,theORF5geneandORF6genewereinsertedtopAAV-U6-IRES-hrGFP-SHatCMS2site;(C)pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6,andtwohelperplasmids,
图 2.2 ORF5、ORF6 基因的扩增Fig.2.2 Electrophoresis of amplified ORF5 and ORFM: 2000 Marker; 1: ORF5 (about 630 bp); 3: ORF6 (about 520 bp); 2, 重组载体鉴定结果1 pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA 鉴定的结果体 pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA 测序结果显示 SH 片段已经插对照质粒测序结果显示 N-SH 已插入。2 pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 鉴定的结果阳性质粒以及双酶切的阳性质粒进行琼脂糖凝胶电泳。同时用质粒为模板进行的 PCR 鉴定（见图 2.3）。结合 DNA 测序结果 pAAV-U6-IRES-hrGFP 质粒上，从而双效表达重组载体U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 构建成功，并得到对照质粒V-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6。
pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 的 PCR 鉴定以及双酶tion of pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 by PCR and doF5（about 630 bp）；3：ORF6（about 520 bp）；5：pAAV-U6-IRES-h)；6：pAAV-U6-IRES-hrGFP-shRNA-ORF5-ORF6 (indigestion)；Marker.ORF5-ORF6 的制备病毒包装过程中病毒包装组的培养基颜色由红逐渐变黄下部分细胞变圆并聚集漂浮于培养基中，而以上现象在图 2.4)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]PCR扩增的shRNA表达盒快速筛选PRRSV有效siRNA序列[J]. 贺云霞,华荣虹,周艳君,安同庆,仇华吉,王云峰,童光志. 中国预防兽医学报. 2007(05)
[2]一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法[J]. 吴小兵,董小岩,伍志坚,屈建国,侯云德. 科学通报. 2000(19)
本文编号：3000229
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3000229.html
