DHAV-3感染性克隆构建及其部分生物学活性研究
发布时间：2021-01-26 15:06
鸭病毒性肝炎（Duck viral hepatitis, DVH）是由鸭病毒性肝炎病毒（Duck hepatitisvirus, DHV）引起的一种急性、高致死性传染病；以肝炎为主要特征，主要发生在三周龄以内雏鸭。我国鸭病毒性肝炎主要是由DHAV-1和DHAV-3引起的，雏鸭感染这两种病毒后的临床症状和病理变化极其相似，并且二者在临床上混合感染比较普遍，给该病的有效诊断和防治带来了极大困难。DHAV-1和DHAV-3共同流行是我国许多鸭场采取针对传统基因型主动或被动免疫仍发生鸭病毒性肝炎的主要原因。本研究成功构建了DHAV-3SD1101株全长cDNA感染性克隆，并对其部分生物学活性进行了研究。1、DHAV-3SD1101株感染性克隆的构建及病毒的拯救在本实验室已完成的SD1101株DHAV-3全基因组测序基础上，根据载体pCDNA3.1+与病毒全基因组序列的酶切图谱，设计并合成四对特异引物，应用融合PCR技术分四段扩增DHAV全基因组cDNA，分段克隆到载体pCDNA3.1+中，获得了DHAV-3SD1101株基因组全长cDNA克隆pSDDHAV。通过引物设计的方法，在cDNA的5’...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
DHAV-3病毒基因组结构示意图
图 2-1 DHAV-3 SD1101 株 cDNA 全基因组感染性克隆构建过程Fig. 2-1 Construction of the full-length cDNA clone of DHAV-3 SD1101各个片段具体克隆过程如下：（1）C 片段克隆：如图 2-1 所示，用限制性内切酶 NotⅠ、XhoⅠ分别双酶切载体 pCDNA3.1+，酶切体系均为 60μL：10×H Buffer 6 μL，0.1%BSA6 μL，，NotⅠ 3 μL，XhoⅠ 3 μL，ddH2O 2 μL。胶回收各片段，然后用 T4 DNALigase 试剂盒（TaKaRa）连接 pCDNA3.1+载回收的 C 片段，连接体系为 10μL：pCDNA3.1+载体 1μL，纯化 C 片段 7μL， Ligase Buffer 1μL，T4 DNA Ligase 1 μL，混匀后于 16℃下连接过夜，转化。（2）D 片段克隆：如图 2-1 所示，用 XhoⅠ、XbaⅠ分别酶切载体 pSDC 和 D体系均为 60μL：10×M Buffer 6 μL，DNA40μL，XbaⅠ 3 μL，XhoⅠ 3 μL，胶回收各自片段，然后用 T4 DNALigase 试剂盒（TaKaRa）连接 pSDC 载体与
接种后 36～96h 内只有 3 只鸭胚死亡，收集尿囊液，取出胚体可见针尖大小出血点或出血斑（见图 3-1）。图3-1 接种后死亡的鸭胚胚体Fig. 3-1 The dead duck embryonic plant after inoculateing3.1.2 RT-PCR 鉴定结果收集死亡鸭胚的尿囊液进行总 RNA 提取后，进行 RT-PCR 反应。可见有 871bp 大小的特异性条带出现（图 3-2）。图3-2尿囊液病毒RT-PCR检测结果Fig. 3-2 The result of RT-PCR detection about allantoic fluid samplesM. DL2000 DNAmarker; 1. Negative control 2. Result of RT-PCR
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭甲肝病毒3型2012年山东分离株VP1基因的序列分析[J]. 徐倩,陈琳琳,张瑞华,杨蕾,谢之景,朱岩丽,姜世金,司兴奎. 病毒学报. 2013(05)
[2]I型鸭肝炎病毒在鸭胚成纤维细胞系中的增殖特性研究[J]. 付玉志,张洪辉,李传峰,陈宗艳,王超,陈铁桥,刘光清. 中国预防兽医学报. 2013(02)
[3]基因C型鸭甲肝病毒VP1基因的克隆及原核表达[J]. 皮晋魁,聂培婷,黄秋雪,岳华,张焕容. 中国预防兽医学报. 2012(09)
[4]鸭甲型病毒性肝炎的研究进展[J]. 任丽倩,李晶,毕玉海,陈璨,张大丙,刘文军. 生物工程学报. 2012(07)
[5]鸭Ⅰ型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法建立及初步应用[J]. 谢丽基,谢芝勋,庞耀珊,谢志勤,刘加波,邓显文,范晴. 中国家禽. 2012(10)
[6]鸭肝炎病毒分子流行病学分析[J]. 袁率珍,范书才,李虹,姜畔,张兵. 中国预防兽医学报. 2010(11)
[7]鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析[J]. 邵泽香,韦强,鲍国连,崔言顺,刘燕,王春平,季权安,李建亮. 中国兽医学报. 2010(08)
[8]Ⅰ型鸭肝炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建与分析[J]. 云涛,倪征,刘光清,余斌,陈柳,华炯钢,李双茂,张彦明. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2010(05)
[9]鸭甲肝病毒VP1基因的克隆和序列分析[J]. 彭小薇,徐永亮,王笑言,付余,张大丙. 中国兽医杂志. 2009(09)
[10]基因C型鸭肝炎病毒的分离和鉴定[J]. 潘梦,付余,王笑言,徐永亮,温纳相,王丽艳,张大丙. 中国兽医杂志. 2009(03)
硕士论文
[1]新型鸭肝炎病毒全基因组测序及其VP1基因的克隆表达分析[D]. 赵立娜.山东农业大学 2010
[2]实时荧光定量RT-PCR检测1型鸭病毒性肝炎方法的建立和应用[D]. 杨苗.四川农业大学 2009
本文编号：3001322
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
DHAV-3病毒基因组结构示意图
图 2-1 DHAV-3 SD1101 株 cDNA 全基因组感染性克隆构建过程Fig. 2-1 Construction of the full-length cDNA clone of DHAV-3 SD1101各个片段具体克隆过程如下：（1）C 片段克隆：如图 2-1 所示，用限制性内切酶 NotⅠ、XhoⅠ分别双酶切载体 pCDNA3.1+，酶切体系均为 60μL：10×H Buffer 6 μL，0.1%BSA6 μL，，NotⅠ 3 μL，XhoⅠ 3 μL，ddH2O 2 μL。胶回收各片段，然后用 T4 DNALigase 试剂盒（TaKaRa）连接 pCDNA3.1+载回收的 C 片段，连接体系为 10μL：pCDNA3.1+载体 1μL，纯化 C 片段 7μL， Ligase Buffer 1μL，T4 DNA Ligase 1 μL，混匀后于 16℃下连接过夜，转化。（2）D 片段克隆：如图 2-1 所示，用 XhoⅠ、XbaⅠ分别酶切载体 pSDC 和 D体系均为 60μL：10×M Buffer 6 μL，DNA40μL，XbaⅠ 3 μL，XhoⅠ 3 μL，胶回收各自片段，然后用 T4 DNALigase 试剂盒（TaKaRa）连接 pSDC 载体与
接种后 36～96h 内只有 3 只鸭胚死亡，收集尿囊液，取出胚体可见针尖大小出血点或出血斑（见图 3-1）。图3-1 接种后死亡的鸭胚胚体Fig. 3-1 The dead duck embryonic plant after inoculateing3.1.2 RT-PCR 鉴定结果收集死亡鸭胚的尿囊液进行总 RNA 提取后，进行 RT-PCR 反应。可见有 871bp 大小的特异性条带出现（图 3-2）。图3-2尿囊液病毒RT-PCR检测结果Fig. 3-2 The result of RT-PCR detection about allantoic fluid samplesM. DL2000 DNAmarker; 1. Negative control 2. Result of RT-PCR
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸭甲肝病毒3型2012年山东分离株VP1基因的序列分析[J]. 徐倩,陈琳琳,张瑞华,杨蕾,谢之景,朱岩丽,姜世金,司兴奎. 病毒学报. 2013(05)
[2]I型鸭肝炎病毒在鸭胚成纤维细胞系中的增殖特性研究[J]. 付玉志,张洪辉,李传峰,陈宗艳,王超,陈铁桥,刘光清. 中国预防兽医学报. 2013(02)
[3]基因C型鸭甲肝病毒VP1基因的克隆及原核表达[J]. 皮晋魁,聂培婷,黄秋雪,岳华,张焕容. 中国预防兽医学报. 2012(09)
[4]鸭甲型病毒性肝炎的研究进展[J]. 任丽倩,李晶,毕玉海,陈璨,张大丙,刘文军. 生物工程学报. 2012(07)
[5]鸭Ⅰ型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法建立及初步应用[J]. 谢丽基,谢芝勋,庞耀珊,谢志勤,刘加波,邓显文,范晴. 中国家禽. 2012(10)
[6]鸭肝炎病毒分子流行病学分析[J]. 袁率珍,范书才,李虹,姜畔,张兵. 中国预防兽医学报. 2010(11)
[7]鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析[J]. 邵泽香,韦强,鲍国连,崔言顺,刘燕,王春平,季权安,李建亮. 中国兽医学报. 2010(08)
[8]Ⅰ型鸭肝炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建与分析[J]. 云涛,倪征,刘光清,余斌,陈柳,华炯钢,李双茂,张彦明. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2010(05)
[9]鸭甲肝病毒VP1基因的克隆和序列分析[J]. 彭小薇,徐永亮,王笑言,付余,张大丙. 中国兽医杂志. 2009(09)
[10]基因C型鸭肝炎病毒的分离和鉴定[J]. 潘梦,付余,王笑言,徐永亮,温纳相,王丽艳,张大丙. 中国兽医杂志. 2009(03)
硕士论文
[1]新型鸭肝炎病毒全基因组测序及其VP1基因的克隆表达分析[D]. 赵立娜.山东农业大学 2010
[2]实时荧光定量RT-PCR检测1型鸭病毒性肝炎方法的建立和应用[D]. 杨苗.四川农业大学 2009
本文编号：3001322
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