PiggyBac转座子载体的构建与在牛成纤维细胞中转座位点的分析

发布时间：2021-01-28 03:20

　　本研究利用piggybac转座子为载体将嗜热菌糖苷酶（LacS）基因整合到牛成纤维细胞的基因组中，并分析了piggybac转座子在牛成纤维细胞中的转座效率和转座位点的特性。同时，在研究中探讨了转座子和转座酶二元载体转染牛成纤维细胞时的最佳比例。1．从Puc57载体上克隆的LacS和BLG表达框与从pZGL载体上克隆到的ZGL表达框相连，并且扩增ZGL表达框时设计的上游引物中引入NotⅠ、AflⅡ、NheⅠ酶切位点，下游引物引入SalⅠ、HindⅢ酶切位点，两个表达框经酶切连接后得到质粒pZGL-LacS，测序鉴定。2．通过PCR从pLOX-EGFP上克隆PGK-NEO片段，并在设计引物时在上游引物5端引入NheⅠ酶切位点，下游引物3端加2A和BamHⅠ，然后用NheI，BamHI酶切将得到的片段连接到pEGPF-N1载体中，新构建的质粒记为pEGFP-NEO-N1，再从此质粒上克隆PGK-NEO-EGFP表达框，然后用NheⅠ和AflⅡ双酶切，连接到已经构建好的载体pZGL-LacS中，测序鉴定。3．将转座子和转座酶载体以5：1的比例转染牛成纤维细胞。然后将转基因细胞分别以1：30,1... 

【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区

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【学位级别】：硕士

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DNA转座子的转座机制（a）复制型转座（b）非复制型转座Figure1ThetranspositionoftheDNAtransposon（a）replicatetransposition（b）non-replicatetransposition

图 2 PiggyBac 转座子结构示意图Figure 2 PiggyBac transposon structure diagram1.2.2 PiggyBac 转座子的转座机制一般来说 DNA 转座子在转座过程中都需要合成 DNA，然而 PiggyBac 转座子却不用，PiggyBac 转座酶识别供体 DNA 上 13bp 的反向重复序列，将目的基因剪切下来，剪切下的 DNA 片段上的 TTAA 与互补链的 3’OH 形成发卡结构，插入到受体上时发卡结构打开，解放的 3’OH 与插入位点的 TTAA 共价结合，供体的 TTAA 与受体的 TTAA 互补配对，修复 DNA 链完成转座，无 DNA 合成（如图 3）。转座子转座过程中转座酶起着非常重要的作用。研究表明很多转座酶都属于 DDE 重组酶（具有进化保守性氨基酸两个 Asp 和一个 Glu 的三联体）家族。它具有螺旋-转角-螺旋结构的催化位点，能识别和剪切核苷酸序列，并且可以把供体片段 3’OH 与插入位点直接连接。1.2.3 PiggyBac 转座子的应用

内蒙古农业大学硕士学位论文 5鼠。试验中 PiggyBac 转座子为载体得到的转基因小鼠数量远远多于随机整后为了证明外源整合基因在小鼠中的遗传稳定性，将野生型小鼠的转基因，得到的后代中外源基因同样表达。因此 PiggyBac 转座子在哺乳动物中不效的转座并且转座的外源基因是在下一代中稳定表达的。


本文编号：3004262