弓形虫顶质体中糖酵解酶的进化起源与功能研究
发布时间：2021-01-28 07:36
刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）能够机会性地感染包括人和家禽在内的几乎所有的温血动物并入侵这些宿主的有核细胞。弓形虫的生活史复杂,感染途径多样,并且弓形虫病可严重影响人类健康和畜牧养殖业的发展。然而,目前尚未研制出预防弓形虫感染的有效疫苗和针对弓形虫组织包囊的有效药物。顶质体是顶复门原虫特有的细胞器,来源于二次内共生。顶质体尽管不进行光合作用,但它包含了多条重要的合成代谢途径。由于人类宿主缺乏质体,故顶质体成为重要的药物靶标。除己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸异构酶外,弓形虫的其它糖酵解酶都有两个亚型。其中,丙酮酸激酶PYK2、磷酸甘油酸激酶PGK2和磷酸丙糖异构酶TPI2均定位在顶质体。PYK2被认为催化磷酸烯醇式丙酮酸为顶质体提供丙酮酸和ATP且PGK2被认为催化1,3-二磷酸甘油酸生成3-磷酸甘油酸并产生ATP。因此,本研究旨在对定位在顶质体的糖酵解酶进行生理功能和进化起源分析,为解析弓形虫顶质体的代谢机制提供理论依据。本研究首先对弓形虫的糖酵解酶进行了定位分析,随后对顶质体的PYK2和PGK2进行功能研究,最后对定位在顶质体的糖酵解酶进行进化分析。具体工作包括以下几个...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
弓形虫复杂的生活史(HunterandSibley2012)
形虫糖酵解酶的定位 2007 年，Tobias Fleige 就已经对弓形虫基因组编码的 18 个糖酵解和定位分析。该学者首先找到基因的起始密码子，然后在体外构建编码区 ORF 及 C 端融合 myc 标签的表达质粒，电转表达质粒至弓目的蛋白在虫体内的定位 (Fleige et al 2007)。虽然该方法为这些糖胞定位提供了重要信息,也发现了有些酶定位到顶质体而不是细胞生物学现象。然而，该方法在技术上有一定的缺陷，比如异位表达为编码区预测不准确而导致蛋白定位出现偏差。在弓形虫中，除 余 8 种糖酵解酶都有两个亚型。已有研究明确 ENO1 和 ENO2 表达可与核染色质结合（Jiapeng Ruan 2015）。ALD1 是目前公认的细白而 ALD2 几乎不表达（ToxoDB 数据）。故本研究拟采用原位融的方法重新观察除 ENOs 和 ALDs 外的 14 个糖酵解酶（HK、GPI、PPIs、GAPDHs、PGMs 和 PFKs）的定位,图 4-1 展示的是内源性融的方法观察目的蛋白定位的示意图。
pCRISPR-GAPDH2-Ty 质粒电泳鉴定及：DNA 分子量标准 1：pCRISPR-GAPD2：pCRISPR-GAPDH2-Ty 质粒的 Sal I 酶el electrophoresis of pCRISPR-GAPDH2-Tdigestion of pCRISPR-GAPDH2-Ty plasM: DNA marker 1: pCRISPR-GAPDH2tion of Sal I enzyme digestion of pCRISPR3’UTR-DHFR 质粒为模板，上游引物游引物带有 gRNA 位点后的 50 bp50 bp）的大小为 3845 bp 的 5H-Ty GAPDH2 短同源臂的 5H-Ty-3’UTRer-smFP-DHFR-LoxP-T7（图谱见附的大小为 5505bp 的 5H-smHA-DHF源臂的 5H-smHA-DHFR-3H 片段。
【参考文献】：
期刊论文
[1]人畜共患弓形虫病的防治[J]. 夏奎波. 兽医导刊. 2018(21)
[2]青蒿素类药物治疗疟疾研究进展[J]. 程思佳,符林春. 中国热带医学. 2018(07)
[3]一例猪弓形体病的诊治与体会[J]. 吴太华. 畜禽业. 2017(04)
[4]一例由猪弓形虫病引起流产的诊治[J]. 范永红. 黑龙江动物繁殖. 2017(01)
[5]线粒体丙酮酸载体与肿瘤的研究进展[J]. 李小丽,李亚青,钟亚莉,樊慧杰,张明智,索振河. 医学综述. 2014(16)
[6]我国的食源性寄生虫病及其相关研究进展[J]. 刘明远,刘全,方维焕,尹继刚,王学林,李建华,姜宁,张西臣,白雪,吴秀萍. 中国兽医学报. 2014(07)
[7]顶复门原虫类异戊二烯生物合成途径及其关键酶的研究进展[J]. 廖申权,吴彩艳,戚南山,吕敏娜,覃宗华,孙铭飞. 动物医学进展. 2012(02)
[8]抗弓形虫药物研究进展[J]. 张瑞岩,刘全,商立民,吴永魁. 动物医学进展. 2010(01)
[9]顶复门寄生虫顶质体的研究进展[J]. 张维,刘群. 中国兽医科学. 2006(08)
博士论文
[1]与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定[D]. 王一凡.华中农业大学 2015
本文编号：3004602
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
弓形虫复杂的生活史(HunterandSibley2012)
形虫糖酵解酶的定位 2007 年，Tobias Fleige 就已经对弓形虫基因组编码的 18 个糖酵解和定位分析。该学者首先找到基因的起始密码子，然后在体外构建编码区 ORF 及 C 端融合 myc 标签的表达质粒，电转表达质粒至弓目的蛋白在虫体内的定位 (Fleige et al 2007)。虽然该方法为这些糖胞定位提供了重要信息,也发现了有些酶定位到顶质体而不是细胞生物学现象。然而，该方法在技术上有一定的缺陷，比如异位表达为编码区预测不准确而导致蛋白定位出现偏差。在弓形虫中，除 余 8 种糖酵解酶都有两个亚型。已有研究明确 ENO1 和 ENO2 表达可与核染色质结合（Jiapeng Ruan 2015）。ALD1 是目前公认的细白而 ALD2 几乎不表达（ToxoDB 数据）。故本研究拟采用原位融的方法重新观察除 ENOs 和 ALDs 外的 14 个糖酵解酶（HK、GPI、PPIs、GAPDHs、PGMs 和 PFKs）的定位,图 4-1 展示的是内源性融的方法观察目的蛋白定位的示意图。
pCRISPR-GAPDH2-Ty 质粒电泳鉴定及：DNA 分子量标准 1：pCRISPR-GAPD2：pCRISPR-GAPDH2-Ty 质粒的 Sal I 酶el electrophoresis of pCRISPR-GAPDH2-Tdigestion of pCRISPR-GAPDH2-Ty plasM: DNA marker 1: pCRISPR-GAPDH2tion of Sal I enzyme digestion of pCRISPR3’UTR-DHFR 质粒为模板，上游引物游引物带有 gRNA 位点后的 50 bp50 bp）的大小为 3845 bp 的 5H-Ty GAPDH2 短同源臂的 5H-Ty-3’UTRer-smFP-DHFR-LoxP-T7（图谱见附的大小为 5505bp 的 5H-smHA-DHF源臂的 5H-smHA-DHFR-3H 片段。
【参考文献】：
期刊论文
[1]人畜共患弓形虫病的防治[J]. 夏奎波. 兽医导刊. 2018(21)
[2]青蒿素类药物治疗疟疾研究进展[J]. 程思佳,符林春. 中国热带医学. 2018(07)
[3]一例猪弓形体病的诊治与体会[J]. 吴太华. 畜禽业. 2017(04)
[4]一例由猪弓形虫病引起流产的诊治[J]. 范永红. 黑龙江动物繁殖. 2017(01)
[5]线粒体丙酮酸载体与肿瘤的研究进展[J]. 李小丽,李亚青,钟亚莉,樊慧杰,张明智,索振河. 医学综述. 2014(16)
[6]我国的食源性寄生虫病及其相关研究进展[J]. 刘明远,刘全,方维焕,尹继刚,王学林,李建华,姜宁,张西臣,白雪,吴秀萍. 中国兽医学报. 2014(07)
[7]顶复门原虫类异戊二烯生物合成途径及其关键酶的研究进展[J]. 廖申权,吴彩艳,戚南山,吕敏娜,覃宗华,孙铭飞. 动物医学进展. 2012(02)
[8]抗弓形虫药物研究进展[J]. 张瑞岩,刘全,商立民,吴永魁. 动物医学进展. 2010(01)
[9]顶复门寄生虫顶质体的研究进展[J]. 张维,刘群. 中国兽医科学. 2006(08)
博士论文
[1]与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定[D]. 王一凡.华中农业大学 2015
本文编号：3004602
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3004602.html
