胸膜肺炎放线杆菌CpxA/R双组份调控系统基因缺失突变株构建及生物学特性研究
发布时间：2021-01-28 18:54
猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP）,是由猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起的一种猪的传染性呼吸道疾病,是造成世界范围内养猪业经济损失的一个主要问题。临床上,该病以肺部有出血性,纤维素性渗出和坏死性损害为主要诊断特征,随着耐药菌株的出现而变得日趋难以应对。尽管目前很多与APP致病有关的毒力因子已被报道,但由于其调控网络错综复杂,它们在APP的整个感染和致病过程中究竟起着怎么样的作用,目前仍不完全清楚。双组份调控系统（Two-Component Regulatory System,TCS）是细菌感应外界环境变化最普遍的信号传递装置,通过感知外界环境信号变化并做出应答从而适应生长环境的变化。此外,在病原菌的感染过程中发挥着重要的作用,如调节细菌生长代谢、耐药性、毒力表达等。对已完成测序的APP血清3型JL03全基因组序列分析发现,在APP中共有五对双组份,分别是ArcA/ArcB, CpxA/CpxR, NarP/NarQ, PhoB/PhoR, QseB/QseC。...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
縮略词（Abbreviation）
第一章 文献综述
1.1 胸膜肺炎放线杆菌概述
1.1.1 病原学
1.1.2 流行病学
1.1.3 猪传染性胸膜肺炎的致病机理
1.1.4 胸膜肺炎放线杆菌毒力因子研究进展
1.2 双组份调控系统
1.2.1 双组份调控系统概述
1.2.2 胸膜肺炎放线杆菌TCS研究现状
1.2.3 CpxA/R双组份调控系统研究现状
第二章 研究目的与意义
第三章 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 菌种、质粒和培养条件
3.1.2 各种酶类和试剂
3.1.3 培养基以及抗生素的配制
3.1.4 主要溶液的配制
3.2 实验方法
3.2.1 胸膜肺炎放线杆菌基因组的提取
3.2.2 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
3.2.3 连接产物的转化
3.2.4 质粒的小量制备
3.2.5 质粒的大量制备（碱裂解法）
3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
3.2.7 胸膜肺炎放线杆菌电转化
3.2.8 Southern blotting
3.2.9 RNA的抽提
3.2.10 SLW01菌株中CpxA、CpxR基因上下游同源臂的扩增与鉴定
3.2.11 重组转移质粒pEM-CpxA/R的构建
3.2.12 突变株△CpxA/R的构建
3.2.13 △CpxA/R互补菌株C△CpxA/R的构建与鉴定
3.2.14 双基因缺失突变株△CpxA/R与互补菌株C△CpxA/R的生物学特性分析
3.2.15 实时荧光定量差异基因的筛选
3.2.16 反应调节蛋白CpxR的表达纯化
3.2.17 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
第四章 结果与分析
4.1 双组份调控系统CPXA/R基因结构分析
4.2 CPXAR双基因上下游同源臂的扩增
4.3 重组转移自杀性质粒PEM-CPXA/R的构建与鉴定
4.4 双基因缺失突变株△CPXA/R的筛选和PCR鉴定
4.5 △CPXA/R双基因缺失突变株的测序鉴定和SOUTHERN BLOT鉴定
4.5.1 测序鉴定
4.5.2 △CpxA/R双基因缺失突变株的Southern blot鉴定
4.6 双基因缺失突变株△CPXA/R的遗传稳定性分析
4.7 △CPXA/R互补菌株CACPXA/R的构建与鉴定
4.8 双基因缺失突变株△CPXA/R的生长特性分析
4.9 双基因缺失突变株△CPXA/R的溶血活性分析
4.10 双基因缺失突变株△CPXA/R的小鼠致病力分析
4.11 细菌透射电镜
4.12 细胞吞噬试验
4.13 细胞黏附试验
4.14 细胞侵入试验
4.15 荧光定量PCR
4.16 反应调控蛋白CPXR的表达
第五章 讨论
5.1 两步单交换法构建缺失突变株
5.2 APP中CPXA/R双组份调控系统可能的功能
5.3 后续展望
第六章 结论
参考文献
致谢
附表：11个被筛选基因QRT-PCR差异表达情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪传染性胸膜肺炎的诊断与防治[J]. 蔡宝祥. 辽宁畜牧兽医. 1996(03)
[2]我国猪胸膜肺炎嗜血杆菌感染症的确定和诊断[J]. 杨旭夫,彭发泉. 畜牧兽医学报. 1990(03)
博士论文
[1]胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxIV的致病性及基因缺失弱毒疫苗的研究[D]. 刘金林.华中农业大学 2009
[2]胸膜肺炎放线杆菌和猪瘟病毒的基因组测序与比较基因组学研究[D]. 徐卓菲.华中农业大学 2008
[3]胸膜肺炎放线杆菌△apxIC/△apxIIC双基因缺失株的构建及其生物学特性和免疫原性的研究[D]. 林荔雯.华中农业大学 2007
[4]猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株构建及其生物学特性研究[D]. 贝为成.华中农业大学 2005
硕士论文
[1]胸膜肺炎放线杆菌双组份调控系统QseB/QseC突变株构建功能研究[D]. 胡琳琳.华中农业大学 2011
[2]猪胸膜肺炎放线杆菌双组分调控系统ΔnarQ/narP突变株构建及功能研究[D]. 刘源.华中农业大学 2010
本文编号：3005505
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
縮略词（Abbreviation）
第一章 文献综述
1.1 胸膜肺炎放线杆菌概述
1.1.1 病原学
1.1.2 流行病学
1.1.3 猪传染性胸膜肺炎的致病机理
1.1.4 胸膜肺炎放线杆菌毒力因子研究进展
1.2 双组份调控系统
1.2.1 双组份调控系统概述
1.2.2 胸膜肺炎放线杆菌TCS研究现状
1.2.3 CpxA/R双组份调控系统研究现状
第二章 研究目的与意义
第三章 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 菌种、质粒和培养条件
3.1.2 各种酶类和试剂
3.1.3 培养基以及抗生素的配制
3.1.4 主要溶液的配制
3.2 实验方法
3.2.1 胸膜肺炎放线杆菌基因组的提取
3.2.2 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
3.2.3 连接产物的转化
3.2.4 质粒的小量制备
3.2.5 质粒的大量制备（碱裂解法）
3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
3.2.7 胸膜肺炎放线杆菌电转化
3.2.8 Southern blotting
3.2.9 RNA的抽提
3.2.10 SLW01菌株中CpxA、CpxR基因上下游同源臂的扩增与鉴定
3.2.11 重组转移质粒pEM-CpxA/R的构建
3.2.12 突变株△CpxA/R的构建
3.2.13 △CpxA/R互补菌株C△CpxA/R的构建与鉴定
3.2.14 双基因缺失突变株△CpxA/R与互补菌株C△CpxA/R的生物学特性分析
3.2.15 实时荧光定量差异基因的筛选
3.2.16 反应调节蛋白CpxR的表达纯化
3.2.17 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
第四章 结果与分析
4.1 双组份调控系统CPXA/R基因结构分析
4.2 CPXAR双基因上下游同源臂的扩增
4.3 重组转移自杀性质粒PEM-CPXA/R的构建与鉴定
4.4 双基因缺失突变株△CPXA/R的筛选和PCR鉴定
4.5 △CPXA/R双基因缺失突变株的测序鉴定和SOUTHERN BLOT鉴定
4.5.1 测序鉴定
4.5.2 △CpxA/R双基因缺失突变株的Southern blot鉴定
4.6 双基因缺失突变株△CPXA/R的遗传稳定性分析
4.7 △CPXA/R互补菌株CACPXA/R的构建与鉴定
4.8 双基因缺失突变株△CPXA/R的生长特性分析
4.9 双基因缺失突变株△CPXA/R的溶血活性分析
4.10 双基因缺失突变株△CPXA/R的小鼠致病力分析
4.11 细菌透射电镜
4.12 细胞吞噬试验
4.13 细胞黏附试验
4.14 细胞侵入试验
4.15 荧光定量PCR
4.16 反应调控蛋白CPXR的表达
第五章 讨论
5.1 两步单交换法构建缺失突变株
5.2 APP中CPXA/R双组份调控系统可能的功能
5.3 后续展望
第六章 结论
参考文献
致谢
附表：11个被筛选基因QRT-PCR差异表达情况
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪传染性胸膜肺炎的诊断与防治[J]. 蔡宝祥. 辽宁畜牧兽医. 1996(03)
[2]我国猪胸膜肺炎嗜血杆菌感染症的确定和诊断[J]. 杨旭夫,彭发泉. 畜牧兽医学报. 1990(03)
博士论文
[1]胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxIV的致病性及基因缺失弱毒疫苗的研究[D]. 刘金林.华中农业大学 2009
[2]胸膜肺炎放线杆菌和猪瘟病毒的基因组测序与比较基因组学研究[D]. 徐卓菲.华中农业大学 2008
[3]胸膜肺炎放线杆菌△apxIC/△apxIIC双基因缺失株的构建及其生物学特性和免疫原性的研究[D]. 林荔雯.华中农业大学 2007
[4]猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅡ基因工程突变株构建及其生物学特性研究[D]. 贝为成.华中农业大学 2005
硕士论文
[1]胸膜肺炎放线杆菌双组份调控系统QseB/QseC突变株构建功能研究[D]. 胡琳琳.华中农业大学 2011
[2]猪胸膜肺炎放线杆菌双组分调控系统ΔnarQ/narP突变株构建及功能研究[D]. 刘源.华中农业大学 2010
本文编号：3005505
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