TALENs介导的山羊BLG基因敲除和hLF基因敲入的研究

发布时间：2021-02-03 10:45

　　TALENs技术是最近几年来迅速发展起来的基因靶向修饰技术,该技术能够简单、高效的在目标靶基因位点处产生多种突变效应,现已被广泛应用于各种动植物细胞及个体的基因修饰研究中。与经典的基因打靶技术相比,TALEN核酸酶在与基因打靶载体的共同作用下,具有“一步法”完成目标基因的敲除和外源基因定点敲入的优势。本研究通过利用TALENs基因编辑技术和hLF基因打靶载体在山羊BLG基因第一外显子起始密码子附近敲除目标靶序列,并在敲除位点引入人乳铁蛋白基因,从而降低山羊乳汁中对人具有致敏作用的p-乳球蛋白的含量,提高羊奶的营养和消费价值。本研究的目的是应用TALENs技术与山羊β-乳球蛋白调控序列,PCR扩增获得的hLF cDNA基因序列,人巨细胞病毒启动／增强子（Pcmv）和SV40 poly A以及HSV-TK的负筛选基因等元件,构建含新霉素抗性筛选基因（Neo）的乳腺特异性表达hLF的基因打靶载体。用构建获得的TALENs和乳腺特异性打靶载体转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选获得转基因单克隆细胞株,并通过体细胞核移植技术制备在BLG基因上定点敲入hLF的转基因山羊。移植受体并通过怀孕出生的转基因山羊... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
符号说明
第一章 文献综述
    1. 动物基因打靶的研究进展
        1.1 动物基因打靶的简介
        1.2 动物基因打靶技术的应用和前景
        1.3 基因打靶的新技术
        1.4 动物基因打靶中存在的障碍和优化措施
    2. TALENs基因定点修饰技术研究进展
        2.1 TALENs基因修饰技术简介
        2.2 TALENs的基本结构与技术原理
        2.3 TALENs的设计与构建
        2.4 TALENs的应用和展望
    3. 人乳铁蛋白的研究进展
        3.1 人乳铁蛋白的基因及其蛋白
        3.2 人乳铁蛋白的主要生理作用
        3.3 转基因动物乳腺特异性表达重组hLF的研究进展
第二章 山羊BLG基因TALENs的设计与构建
    1. 实验材料
        1.1 主要试剂
        1.2 试验仪器及器材
        1.3 主要试剂的配制
    2. 实验方法
        2.1 BLG基因的检索
        2.2 TALENs的设计
        2.3 TALENs表达载体的构建与鉴定
    3. 结果
第三章 乳腺特异性表达hLF基因打靶载体的构建
    1. 试验材料
        1.1 菌种及质粒
        1.2 试验仪器
        1.3 分子生物学试剂
        1.4 主要试剂的配制
    2. 实验方法
        2.1 PCR引物合成和测序
        2.2 常规分子生物学的操作方法
        2.3 质粒酶切反应
        2.4 酶切产物的回收
        2.5 连接反应
    3. 乳腺特异性打靶载体的构建
        3.1 PCR扩增BLG5’、BLG3’调控序列和乳腺特异性表达载体功能区
        3.2 山羊BLG5’调控序列和乳腺特异性表达载体功能区相连
        3.3 山羊BLG3’调控序列和表达载体BF相连
        3.4 含单个负筛选HSV-TK基因与乳腺特异性表达载体BFN-7相连
    4. 结果
        4.1 山羊BLG5’和BLG3’调控序列的扩增
        4.2 PCR扩增乳腺特异性表达载体功能区
        4.3 乳腺特异性表达hLF基因打靶载体的构建
第四章 基因打靶细胞系和基因打靶山羊的制备
    1. 试验材料
        1.1 试验仪器
        1.2 试验器械
        1.3 主要试剂
        1.4 试验动物
    2. 试验方法
        2.1 胎儿成纤维细胞的准备
        2.2 打靶载体与TALENs转染胎儿成纤维细胞
        2.3 细胞株PCR检测
        2.4 体细胞核移植制作基因打靶山羊胎儿
    3. 结果
        3.1 抗性细胞株的整合检测
        3.2 转染基因打靶载体细胞统计结果
    4. 讨论
第五章 全文总结
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1基因[J]. 郑道山,冯冲,朱彦宾,龙川,冯书堂,潘登科,马文丽.  生物技术通讯. 2011(04)
[2]Myostatin基因打靶载体的构建及猪胎儿成纤维细胞Myostatin基因的敲除[J]. 李鸿辉,冯冲,王宁,闫军,哈福,陈红星,樊宝良,潘登科.  生物技术通讯. 2010(05)
[3]基因打靶定点突变秦川牛MSTN基因[J]. 刘永刚,华松,兰杰,宋永利,何玉龙,权富生,张涌.  生物工程学报. 2010(03)
[4]利用多重筛选机制提高山羊乳腺上皮细胞基因打靶的效率[J]. 沈伟,闵令江,李兰,潘庆杰,吴晓洁,周艳荣,邓继先.  遗传学报. 2005(04)
[5]体细胞基因打靶制备动物乳腺生物反应器的策略与应用[J]. 沈伟,2.杨正田,邓继先.  生物工程学报. 2003(06)

博士论文
[1]乳蛋白与CMV复合启动子驱动hLF cDNA乳腺特异性表达[D]. 成勇.南京农业大学 2007
[2]小尾寒羊骨骼肌细胞Myostatin基因打靶的研究[D]. 张蕾.中国农业大学 2005

硕士论文
[1]hLF基因打靶山羊胎儿成纤维细胞株的建立及其整合位点的分析[D]. 孙丽新.华东师范大学 2004



本文编号：3016375