猪骨骼肌/肝脏特异性表达基因MyoG/α1-AT启动子的功能分析及应用

发布时间：2021-02-07 20:01

　　启动子是控制基因转录的调控片段。组织特异性启动子是在特定组织和器官中特异性表达基因的启动子。组织特异性启动子在遗传育种及性状改良等应用方面显示出极高的价值。本试验采用猪肌肉特异性基因MyoG的启动子驱动与脂质代谢密切相关的过氧化物酶体增殖物激活受体基因在肌肉中异位表达;采用猪肝脏特异性基因α1-AT启动子以及α1-AT基因的信号肽驱动来源于扣囊复膜酵母的β-葡萄糖苷酶基因在肝脏中异位表达。为构建转基因小鼠模型提供一定的理论基础。取得的主要研究成果如下:1.采用在线软件MEME比对猪、人和小鼠相同区域序列,确定猪MyoG启动子的功能区域位于第一外显子5端附近。克隆猪MyoG基因5’侧翼806bp序列,TESS和TFSEARCH等分析该片段含有启动子的特征元件TATA box和多个转录因子结合位点,如Sp1、E-box、C/EBP、NF-1、Myogenin等。构建含有MyoG启动子的pGL3-MyoG报告质粒,分别转染分化Od、2d、3d、4d、6d的C2C12细胞和3T3-L1细胞。发现MyoG启动子活性在C2C12细胞分化3天时达到最大,随着分化时间的延长,其活性逐渐降低;在3T3-... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：89 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
    1 引言
    2 启动子简介
        2.1 启动子的结构
        2.2 启动子的研究方法
            2.2.1 基于生物信息学的启动子分析
            2.2.2 启动子克隆方法
            2.2.3 研究启动子功能的实验方法
        2.3 启动子的应用
            2.3.1 应用于转基因动物
            2.3.2 应用于RNA干扰
            2.3.3 临床治疗中的应用
    3 MyoG/α1-AT启动子及CKM增强子研究进展
        3.1 MyoG启动子研究进展
        3.2 α1-AT启动子研究进展
        3.3 CKM增强子研究现状
    4 PPARγ的概述
    5 BGL1研究现状
    6 研究目的和意义
第二章 材料与方法
    1 试验材料
        1.1 DNA样品
        1.2 载体和菌株
        1.3 试剂及其配置
            1.3.1 主要试剂
            1.3.2 试剂的配置
        1.4 主要数据库及分析软件
    2 试验方法
        2.1 猪MyoG基因启动子的克隆及重组表达质粒的构建
            2.1.1 猪基因组提取DNA及质量鉴定
            2.1.2 猪MyoG调控序列的获得
            2.1.3 PCR扩增产物的检测和回收
                2.1.3.1 PCR产物的检测
                2.1.3.2 PCR产物的回收及纯化
            2.1.4 克隆载体的构建及酶切回收
                2.1.4.1 PCR产物连接pMD18-T
                2.1.4.2 重组质粒转化
                2.1.4.3 阳性克隆的检测及测序
                2.1.4.4 连接pMD18-T质粒小量提取
            2.1.5 pGL3-MyoG重组表达质粒的构建
                2.1.5.1 pMD18-T及pGL3-Basic载体双酶切及回收
                2.1.5.2 pGL3-Basic重组表达质粒的构建
                2.1.5.3 重组质粒的去内毒素小量提取及双酶切鉴定
        2.2 细胞培养及诱导分化
            2.2.1 细胞的复苏
            2.2.2 细胞的常规培养
            2.2.3 细胞冻存
            2.2.4 C2C12细胞的诱导分化
        2.3 细胞转染及双荧光素酶活性的测定
            2.3.1 细胞的转染
            2.3.2 双荧光素酶相对活性的检测
                2.3.2.1 细胞裂解
                2.3.2.2 双荧光素酶活性的检测及计算
            2.3.3 数据的处理及分析
        2.4 真核表达载体以及MyoG突变载体构建
            2.4.1 转录因子MyoD真核表达质粒的鉴定
            2.4.2 pcDNA3.1-EGFP真核表达质粒的构建
            2.4.3 MyoG突变载体的构建
        2.5 EMSA验证MyoD结合位点的存在
            2.5.1 制备探针
            2.5.2 核蛋白提取
            2.5.3 凝胶迁移试验
        2.6 MyoG启动子与PPARy重组质粒的构建
            2.6.1 猪PPARγ基因CDS区域的克隆
            2.6.2 PPARγ与pGL3-MyoG重组质粒的鉴定
        2.7 PPARγ基因在C2C12细胞中表达量的测定
            2.7.1 小鼠C2C12细胞RNA的提取及反转录
            2.7.2 定量PCR分析PPARγ在C2C12细胞中的表达量
            2.7.3 C2C12细胞蛋白质的提取
            2.7.4 Western Blot检测目的蛋白质的表达量
                2.7.4.1 SDS-PAGE电泳
                2.7.4.2 转膜
                2.7.4.3 抗原抗体免疫反应
        2.8 肌肉特异性表达外源基因转基因小鼠的制备与鉴定
            2.8.1 转基因小鼠的制备
            2.8.2 阳性鼠的PCR鉴定
        2.9 嵌合启动子构建
            2.9.1 猪CKM增强子的获得
            2.9.1 猪Enhancer-Promoter嵌合启动子的构建
        2.10 猪α1-AT基因启动子的克隆及重组表达质粒的构建
            2.10.1 猪α1-AT调控序列的获得
            2.10.2 pGL3-Basic重组表达质粒的构建
        2.11 α1-AT启动子与BGL1重组质粒的构建
            2.11.1 α1-AT基因信号肽的克隆
            2.11.2 BGL1基因CDS区域的克隆
            2.11.3 pGL3-AT-Signal-BGL1重组质粒的构建
        2.12 BGL1基因在Hepa1-6细胞中表达量的测定
            2.12.1 定量PCR分析BGL1在Hepa1-6细胞中的表达量
            2.12.2 Western Blot检测BGL1蛋白质的表达量
第三章 结果与分析
    第一部分
        1 猪MyoG调控序列功能分析
            1.1 猪MyoG调控区域的生物信息学分析
                1.1.1 猪MyoG调控区域的结构预测
            1.2 猪MyoG启动子克隆及重组质粒的构建
            1.3 C2C12细胞的诱导分化
            1.4 pGL3-MyoG-Basic质粒的双荧光素酶活性检测
            1.5 转录因子MyoD对MyoG启动子的调控作用
                1.5.1 转录因子MyoD真核表达载体与启动子片段共转染
                1.5.2 转录因子MyoD真核表达载体与MyoG突变载体共转染
                1.5.3 EMSA验证MyoD结合位点的存在
        2 PPARγ表达载体的构建及其表达量测定
            2.1 PPARγ表达载体的构建
            2.2 QPCR检测PPARγ在C2C12细胞中的表达量
            2.3 Western Blot检测PPARγ蛋白质在C2C12细胞中的表达量
            2.4 转基因小鼠的获得
                2.4.1 转基因小鼠PCR检测
        3 猪CKM增强子活性的验证
            3.1 含有Enhancer-Promoter载体的构建
    第二部分
        1 猪α1-AT基因调控序列功能分析
            1.1 猪α1-AT调控区域的生物信息学分析
            1.2 猪α1-AT启动子克隆及缺失重组质粒的构建
            1.3 α1-AT缺失重组质粒的双荧光素酶活性检测
        2 BGL1基因表达载体的构建及其表达量测定
            2.1 BGL1表达载体的构建
            2.2 QPCR检测BGL1在Hepa1-6细胞中的表达量
            2.3 Western Blot检测蛋白质BGL1在Hepa1-6细胞中的表达量
第四章 讨论
    1 启动子的组织特异性研究
    2 启动子分析
        2.1 猪MyoG启动子的活性分析
        2.2 转录因子MyoD对启动子活性的影响
        2.3 α1-AT启动子的活性分析
    3 猪CKM增强子功能分析
    4 异位表达PPARγ对骨骼肌的影响
    5 肝脏特异性表达BGL1基因的意义
第五章 小结
    1 本研究取得的成果
    2 下一步工作计划
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]成肌细胞成脂过程中PPARγ、C/EBPα和Myogenin基因启动子的甲基化变化[J]. 姜美华,巨婷婷,刘洋,许玲,孙文娟,赵泮峰,尹靖东.  中国农业科学. 2013(14)
[2]携带不同数量增强子的嵌合型肝脏特异性启动子的构建及其体外实验研究[J]. 李文博,张伟峰,陈胤伯,王东阳,张琛,夏海滨.  中国生物工程杂志. 2012(01)
[3]山羊MyoG基因启动子区序列分析与结构预测[J]. 刘铮铸,巩元芳,张文香,付志新,张传生,宋瑜,马艳华.  畜牧兽医学报. 2012(01)
[4]牛MyoG基因启动子的克隆及功能的初步分析[J]. 王秋华,曹允考,李树峰,佟慧丽,兴孝友,李光鹏,严云勤.  畜牧兽医学报. 2012(01)
[5]真核生物启动子的研究及应用[J]. 黄玉,杨波,迟小华,刘丽宏,李薇,卢学春.  生物技术通讯. 2010(02)
[6]甘肃马鹿肌细胞生成素（MyoG）基因启动子区序列克隆与分析[J]. 宋兴超,荣敏,邢秀梅,杨福合.  特产研究. 2009(02)
[7]利用多模板Y形接头延伸法进行相邻序列的连续扩增（英文）[J]. 肖月华,彭祎,罗明,李德谋,侯磊,裴炎.  植物生理与分子生物学学报. 2007(01)



本文编号：3022750