重组杆状病毒高效表达猪圆环病毒2型Cap蛋白及免疫原性分析
发布时间：2021-02-08 06:36
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合症（postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）的主要病原。组织中高含量的病毒血症、PCV2病毒载量、肉芽肿性炎症、淋巴细胞减少和因免疫抑制造成的淋巴系统功能紊乱是严重感染PCV2的特征。目前预防猪圆环病毒2型感染的主要手段是疫苗接种。我国PCV2商品化疫苗包括全病毒灭活疫苗、原核系统表达的病毒样颗粒（VLP）疫苗、杆状病毒载体系统表达的亚单位疫苗等,但普遍存在的问题是灭活疫苗和亚单位疫苗抗原量不高,或是纯化抗原中内毒素残存量较多,导致免疫效果低下及副作用明显;很多大型猪场选择采用进口疫苗,但进口疫苗价格昂贵。为解决这些问题或缺陷,本研究采用Bac-to-BacTM杆状病毒表达载体系统,构建了高效表达PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒。本研究的主要内容如下:1对转移载体pFastBacI进行了改造,即polh启动子后连接了另一个启动子,采用了双启动子策略;同时,在polh启动子上游增加了同源增强子调控元件。2 C...
【文章来源】：吉林农业大学吉林省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PCV2基因组图解
图 2.1 pFastBacI 转移载体Fig.2.1 pFastBacI transfer vector霉素、四环素、庆大霉素、IPTG 和 X烯酰胺溶液购自 CWBIO 公司；转膜司；一次性细胞培养皿、细胞培养摇DS-PAGE loading buffer、10×DNAloaap、高保真 PrimeSTAR Max Premix 和KaRa 公司；KpnI、XbaI 限制性内切酶Agel Extraction kit 及 Body Fluid Viral；转染试剂 TransIT -LTI 购自 MIRU术研究所；血球计数板购自百泰贸易天生物技术公司；鼠抗 His 单克隆抗自康为世纪公司。
图 2.2 重组杆状病毒构建路线Fig.2.2 The generation of recombinant baculovirus2.2 昆虫细胞培养Sf9 细胞系：在一次性细胞培养皿中传代，使用含有 10%热灭活胎牛血清的00TMII 培养基，在 27℃的温湿培养箱（无需补充 5% CO2气体）中静置培养，时，使用无菌枪头轻轻吹起细胞，补充新鲜培养基，2～3 天进行一次传代。H5 细胞系：使用无菌摇瓶在 27℃、110rpm 的摇床上悬浮培养，培养基为无的 Sf-900TMII，2～3 天进行一次传代。2.3 转移质粒改造依据H5细胞对密码子的偏好性，PCV2 Cap基因于金唯智公司进行了优化，成了含有增强子、双启动子和 Cap 的基因片段（如图 2.3）。根据优化后 Cap序列和载体序列设计了含有转移载体同源臂的 Cap 基因引物，以及鉴定重移质粒的 pFastBacI 载体通用引物和鉴定重组杆粒的通用引物 M13（见表
【参考文献】：
期刊论文
[1]动物疫苗中常用抗原灭活剂的研究进展[J]. 徐守振,尹燕博,王新. 中国畜牧兽医. 2010(09)
[2]Baculovirus as a highly efficient expression vector in insect and mammalian cells[J]. Yu-chen HU~1 Department of Chemical Engineering,National Tsing Hua University,Hsinchu,Taiwan,China. Acta Pharmacologica Sinica. 2005(04)
本文编号：3023513
【文章来源】：吉林农业大学吉林省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PCV2基因组图解
图 2.1 pFastBacI 转移载体Fig.2.1 pFastBacI transfer vector霉素、四环素、庆大霉素、IPTG 和 X烯酰胺溶液购自 CWBIO 公司；转膜司；一次性细胞培养皿、细胞培养摇DS-PAGE loading buffer、10×DNAloaap、高保真 PrimeSTAR Max Premix 和KaRa 公司；KpnI、XbaI 限制性内切酶Agel Extraction kit 及 Body Fluid Viral；转染试剂 TransIT -LTI 购自 MIRU术研究所；血球计数板购自百泰贸易天生物技术公司；鼠抗 His 单克隆抗自康为世纪公司。
图 2.2 重组杆状病毒构建路线Fig.2.2 The generation of recombinant baculovirus2.2 昆虫细胞培养Sf9 细胞系：在一次性细胞培养皿中传代，使用含有 10%热灭活胎牛血清的00TMII 培养基，在 27℃的温湿培养箱（无需补充 5% CO2气体）中静置培养，时，使用无菌枪头轻轻吹起细胞，补充新鲜培养基，2～3 天进行一次传代。H5 细胞系：使用无菌摇瓶在 27℃、110rpm 的摇床上悬浮培养，培养基为无的 Sf-900TMII，2～3 天进行一次传代。2.3 转移质粒改造依据H5细胞对密码子的偏好性，PCV2 Cap基因于金唯智公司进行了优化，成了含有增强子、双启动子和 Cap 的基因片段（如图 2.3）。根据优化后 Cap序列和载体序列设计了含有转移载体同源臂的 Cap 基因引物，以及鉴定重移质粒的 pFastBacI 载体通用引物和鉴定重组杆粒的通用引物 M13（见表
【参考文献】：
期刊论文
[1]动物疫苗中常用抗原灭活剂的研究进展[J]. 徐守振,尹燕博,王新. 中国畜牧兽医. 2010(09)
[2]Baculovirus as a highly efficient expression vector in insect and mammalian cells[J]. Yu-chen HU~1 Department of Chemical Engineering,National Tsing Hua University,Hsinchu,Taiwan,China. Acta Pharmacologica Sinica. 2005(04)
本文编号：3023513
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