不同佐剂对金黄色葡萄球菌CP8-FnBPB-ClfA多价毒力因子疫苗免疫效果影响的研究

发布时间：2021-02-11 06:05

　　奶牛乳房炎（Bovine mastitis）是由于奶牛乳腺组织被外界因素所刺激而发生的炎症反应。奶牛患乳房炎后,乳腺组织遭到损伤,导致组织病变、乳中体细胞数增加、产奶量和牛奶品质下降。由于病原微生物是导致奶牛乳房炎的最主要因素,因此,本研究针对金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎,在本实验室过去的研究基础上,自制了CP8-FnBPB-ClfA金黄色奶牛乳房炎疫苗,并通过兔乳房炎模型对佐剂进行筛选,确定其免疫途径后,与CP8-FnBPB-ClfA配合免疫奶牛,评价其免疫效果,结果如下：1.在以前的基础上,提取出已被本实验室鉴定为血清8型S.aureus的荚膜多糖1.7970g,将含FnBPB-ClfA融合蛋白的质粒在大肠杆菌中表达并将其与CP8偶联,得到CP8-FnBPB-ClfA。2.以CP8-FnBPB-ClfA为疫苗,分别配合弗氏佐剂、铝胶盐水佐剂、脂质体佐剂和大肠杆菌不耐热肠毒素B（LTB）佐剂,对新西兰大耳白兔进行免疫,在免疫后不同时期,通过间接ELISA法和Western blot对各组兔血清中的抗体进行监测,评价体液免疫效果；通过检测Th1/Th2类细胞因子水平检测及T淋巴细胞增殖试... 

【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区

【文章页数】：97 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
插图和附表清单
縮略语表
1 引言
    1.1 奶牛乳房炎的分类
        1.1.1 临床型奶牛乳房炎
        1.1.2 隐性奶牛乳房炎
    1.2 金黄色葡萄球菌研究进展
        1.2.1 生物学特性
        1.2.2 金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎致病机制研究进展
            1.2.2.1 金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺的感染
            1.2.2.2 金黄色葡萄球菌的毒力因子
            1.2.2.3 金黄色葡萄球菌与宿主的相互作用
    1.3 金黄色葡萄球菌疫苗研究进展
        1.3.1 灭活疫苗
        1.3.2 以金黄色葡萄球菌荚膜多糖为靶位的疫苗
            1.3.2.1 荚膜多糖研究概况
            1.3.2.2 荚膜多糖的血清型
            1.3.2.3 荚膜多糖的生化组成
            1.3.2.4 荚膜多糖疫苗
        1.3.3 以金黄色葡萄球菌粘附素为靶位的疫苗
            1.3.3.1 粘附素研究概况
            1.3.3.2 纤连素结合蛋白
            1.3.3.3 凝集因子A
            1.3.3.4 粘附素疫苗
    1.4 免疫佐剂研究进展
        1.4.1 弗氏佐剂
        1.4.2 铝胶盐水佐剂
        1.4.3 脂质体佐剂
        1.4.4 大肠杆菌不耐热肠毒素B佐剂
    1.5 金黄色葡萄球菌性乳房炎疫苗对本动物免疫研究概况
    1.6 选题的目的和意义
2 研究一 金黄色葡萄球菌血清8型CP的提取和纯化
    2.1 试验材料
        2.1.1 菌种
        2.1.2 培养基及主要试剂
        2.1.3 主要仪器
    2.2 试验流程
    2.3 试验方法
        2.3.1 S.aureus的活化与培养
        2.3.2 S.aureus的处理
        2.3.3 荚膜多糖的提取
        2.3.4 荚膜多糖粗提物含量的测定
        2.3.5 荚膜多糖粗提物的纯化
    2.4 试验结果
        2.4.1 S.aureus的活化与培养
        2.4.2 荚膜多糖的提取
        2.4.3 荚膜多糖粗提物含量的测定
        2.4.4 荚膜多糖粗提物的纯化
    2.5 讨论
    2.6 小结
3 研究二 FnBPB-ClfA融合蛋白的诱导表达以及与CP8的偶联
    3.1 试验材料
        3.1.1 菌种
        3.1.2 培养基及主要试剂
        3.1.3 试验主要仪器
    3.2 试验流程
    3.3 试验方法
        3.3.1 FnBPB-ClfA融合蛋白的表达
        3.3.2 SDS-PAGE分析
+亲和柱的再生">        3.3.3 Ni⁺亲和柱的再生
        3.3.4 融合蛋白的纯化
        3.3.5 血清8型荚膜多糖的活化衍生
        3.3.6 血清8型荚膜多糖与融合蛋白的偶联
    3.4 试验结果
        3.4.1 FnBPB-ClfA融合蛋白的表达及纯化
        3.4.2 血清8型荚膜多糖与融合蛋白的偶联
    3.5 讨论
    3.6 小结
4 研究三 CP8-FnBPB-ClfA配合不同佐剂免疫学特性的研究
    4.1 试验材料
        4.1.1 阳性血清
        4.1.2 主要试剂
    4.2 试验流程
    4.3 试验方法
        4.3.1 CP8-FnBPB-ClfA的制备
        4.3.2 弗氏佐剂与CP8-FnBPB-ClfA混合疫苗的制备
        4.3.3 铝胶盐水佐剂与CP8-FnBPB-ClfA混合疫苗的制备
        4.3.4 脂质体佐剂与CP8-FnBPB-ClfA混合疫苗的制备
        4.3.5 LTB与CP8-FnBPB-ClfA混合疫苗的制备
        4.3.6 与CP8-FnBPB-ClfA偶联物配合免疫最佳佐剂的筛选
            4.3.6.1 动物的处置
            4.3.6.2 兔血清中CP8,FnBPB,ClfA,FnBPB-ClfA和CP8-FnBPB-ClfA抗体的测定
            4.3.6.3 兔血清中IgG含量的测定
            4.3.6.4 Western blot鉴定
            4.3.6.5 兔血清中总IgG含量及Th1/Th2细胞因子水平测定
            4.3.6.6 T淋巴细胞增殖试验
        4.3.7 最佳免疫部位的筛选
            4.3.7.1 动物的分组与处置
            4.3.7.2 不同部位免疫动物时血清中总IgG含量及Th1/Th2细胞因子水平测定
        4.3.8 攻毒试验
    4.4 试验结果
        4.4.1 与CP8-FnBPB-ClfA配合免疫最佳佐剂的筛选
            4.4.1.1 兔血清中CP8,FnBPB,ClfA,FnBPB-ClfA和CP8-FnBPB-ClfA抗体的测定
            4.4.1.2 兔血清中IgG含量的测定
            4.4.1.3 Western blot鉴定
            4.4.1.4 兔血清中总IgG含量测定
            4.4.1.5 兔血清中Th1/Th2细胞因子水平测定
            4.4.1.6 T淋巴细胞增殖试验
        4.4.2 最佳免疫部位的筛选
            4.4.2.1 不同部位免疫动物时血清中总IgG含量测定
            4.4.2.2 不同部位免疫动物时血清中Th1/Th2细胞因子水平测定
        4.4.3 攻毒试验
    4.5 讨论
    4.6 小结
5 研究四 CP8-FnBPB-ClfA偶联物配合ALUM佐剂对本动物免疫效果的研究
    5.1 主要试剂及仪器
    5.2 试验流程
    5.3 试验方法
        5.3.1 抗原的制备
            5.3.1.1 CP8-FnBPB-ClfA的制备
            5.3.1.2 ALUM佐剂与CP8-FnBPB-ClfA混合疫苗的制备
        5.3.2 动物分组与处置
        5.3.3 牛乳中体细胞数测定
        5.3.4 牛乳中细菌的分离鉴定
        5.3.5 牛血清中CP8-FnBPB-ClfA抗体水平测定
        5.3.6 奶牛血清中IgG、IgA含量及牛乳中IgG含量测定
        5.3.7 数据分析
    5.4 试验结果
        5.4.1 牛乳中体细胞数测定
        5.4.2 牛乳中细菌的分离鉴定
        5.4.3 牛血清中CP8-FnBPB-ClfA抗体测定
        5.4.4 牛血清中IgG及IgA含量测定
        5.4.5 牛乳中IgG含量测定
    5.5 讨论
    5.6 小结
6 总体讨论
7 结论
致谢
参考文献
作者简介



本文编号：3028649