猪乙型脑炎病毒SC株的分离鉴定及其部分生物学特性研究

发布时间：2021-02-14 15:30

　　猪乙型脑炎又称之为日本乙型脑炎（Japanese encephalitis）,是由日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一种人畜共患急性传染病。JEV感染主要引发猪繁殖障碍疾病,接种猪乙型脑炎病毒灭活疫苗能有效预防和控制该病。本研究从疑似猪乙型脑炎的临床病料中分离到1株JEV病毒,对其进行了生物学鉴定和适应性培养研究,并使用所培养的细胞适应株作为免疫原成功制备了JEV的兔源高免血清。取流产胎儿脑组织经处理后接种BHK21细胞,每日观察细胞病变,连续观察5天,然后连续盲传。JEV分离株盲传至第6代开始产生细胞病变,接种细胞36h观察到轻微的细胞病变,48h时,细胞病变达80%。针对JEV的E基因设计特异性引物,对盲传后的病毒液进行JEV的检测。结果表明使用所建立的JEV RT-PCR检测方法对产生细胞病变的分离株进行检测扩增出特异性条带,由此表明使用BHK21细胞成功分离到一株JEV病毒,将其命名为JEV-SC株。将检测为阳性的JEV继续传代使其适应BHK21细胞,待出现细胞病变后通过蚀斑实验对所分离的病毒进行纯化。对纯化后的病毒以及不同... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
缩略词
第一章 文献综述
    1 猪乙型脑炎病毒病原学
        1.1 猪乙型脑炎病毒的生物学特征
        1.2 JEV的培养特性
        1.3 JEV的基因表达
    2 猪乙型脑炎病毒疫苗的研究进展
        2.1 乙型脑炎传统型疫苗
            2.1.1 鼠脑灭活苗
            2.1.2 细胞灭活苗
            2.1.3 减毒活疫苗
        2.2 乙脑新型疫苗
            2.2.1 亚单位疫苗
            2.2.2 核酸疫苗
            2.2.3 病毒活载体疫苗
            2.2.4 复制型DNA疫苗
    3 流行病学
    4 JEV致病特点
        4.1 临床症状
        4.2 病理变化
    5 诊断方法
        5.1 病原学诊断
        5.2 血清学检测方法
        5.3 鉴别诊断
    6 防治措施
    7 研究目的及意义
第二章 猪乙型脑炎病毒SC株的分离鉴定
    1 材料
        1.1 实验细胞、菌种及载体
        1.2 实验试剂及配制
        1.3 主要仪器
    2 方法
        2.1 病料采集
        2.2 病料处理
        2.3 病料RNA的提取
        2.4 引物设计
        2.5 反转录制备cDNA
        2.6 病毒的分离与培养
            2.6.1 复苏BHK-21细胞
            2.6.2 病毒分离
        2.7 病毒的鉴定
            2.7.1 病毒的RT-PCR鉴定
            2.7.2 基因的克隆与鉴定
            2.7.3 病毒理化性质鉴定
            2.7.4 间接免疫荧光实验（IFA）
    3 结果
        3.1 病料检测结果
        3.2 病毒的分离
        3.3 病毒的RT-PCR鉴定结果
        3.4 病毒理化性质鉴定结果
        3.5 间接免疫荧光实验（IFA）
    4 讨论
第三章 猪乙型脑炎病毒SC株的纯化及培养特性研究
    1 材料
        1.1 细胞与病毒
        1.2 实验试剂及配制
        1.3 主要仪器
    2 方法
        2.1 JEV-SC株的纯化
        2.2 JEV-SC株的外源病毒检测
        2.3 JEV-SC株的适应性培养
50的测定">        2.4 JEV-SC株病毒TCID₅₀的测定
        2.5 JEV-SC株在BHK-21细胞上的增殖规律
        2.6 JEV-SC株不同代次在BHK-21细胞上的增殖
        2.7 JEV-SC株分别在BHK-21、Vero细胞上的增殖
    3 结果
        3.1 JEV-SC株的纯化
        3.2 JEV-SC株的外源病毒检测
        3.3 JEV-SC株的适应性培养
50的测定">        3.4 病毒TCID₅₀的测定
        3.5 JEV-SC株在BHK-21细胞上的增值规律
        3.6 JEV-SC株不同代次在BHK-21细胞上的增殖
        3.7 JEV-SC株分别在Vero和BHK-21细胞上的病变情况
    4 讨论
        4.1 关于JEV适应性培养
        4.2 关于JEV含量测定方法
        4.3 关于JEV的细胞增殖特性
第四章 猪乙型脑炎病毒高免血清的制备
    1 材料
        1.1 细胞与病毒
        1.2 实验试剂及配制
        1.3 实验用具与器械
        1.4 实验动物
        1.5 免疫原
    2 方法
        2.1 JEV-SC株毒种的检验
            2.1.1 毒种的繁殖
            2.1.2 纯粹性检测
        2.2 免疫接种
            2.2.1 首次免疫
            2.2.2 二次免疫
            2.2.3 第三次免疫
            2.2.4 第四次免疫
        2.3 血液试检
        2.4 兔颈动脉放血采集血清
        2.5 血清的检验
            2.5.1 无菌检验
            2.5.2 特异性鉴定
        2.6 JEV-SC株高免血清的保存
    3 结果
        3.1 JEV-SC株毒种的检验
        3.2 琼脂双扩血清效价测定结果
        3.3 无菌检验结果
        3.4 特异性实验结果
    4 讨论
结论
参考文献
致谢
作者简介及攻读学位期间发表的学术论文
附件


【参考文献】：
期刊论文
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[3]猪流行性乙型脑炎的诊断与防制[J]. 吕茂杰,郁宏伟,王娟,杨保收.  养猪. 2011(06)
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[7]猪乙型脑炎诊断技术[J]. 高群,冯琦璞,王宇.  北京农业. 2011(12)
[8]猪乙型脑炎的诊治[J]. 余俊昌,马登龙.  山东畜牧兽医. 2011(03)
[9]猪乙型脑炎的诊断与综合防控[J]. 陈宏.  养殖技术顾问. 2010(08)
[10]猪乙型脑炎诊治[J]. 应雪娟,陈卫国.  畜禽业. 2010(01)

博士论文
[1]结核杆菌hsp70在乙脑基因工程疫苗研制中的免疫增强作用[D]. 葛菲菲.南京农业大学 2006
[2]猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究[D]. 徐高原.华中农业大学 2005
[3]猪乙型脑炎减毒活疫苗与基因免疫研究[D]. 王祥.华中农业大学 2001

硕士论文
[1]猪乙型脑炎病毒的克隆纯化及其免疫原性研究[D]. 孔嫄嫄.四川农业大学 2012



本文编号：3033474