多杀性巴氏杆菌HN06株新型免疫蛋白的鉴定及PGAM免疫功能研究

发布时间：2021-02-15 02:34

　　多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, Pm）是一种广泛流行于世界各地的病原菌,自然宿主十分广泛。在猪群中能够引起猪萎缩性鼻炎（Atrophic rhinitis, AR）和猪肺疫（Swine plague, SP）,在禽、牛、羊以及家兔等动物中会引起出血性败血症（Haemorrhagic septicaemia, HS）,给养殖业造成了巨大的经济损失。目前预防多杀性巴氏杆菌以免疫接种为主,疫苗类型主要分为以下几种：强毒灭活疫苗,弱毒活疫苗,亚单位疫苗。这些疫苗能在一定程度上对多杀性巴氏杆菌起到预防的作用,但是多杀性巴氏杆菌血清型很多,不同血清型菌株之间缺乏相互交叉的免疫保护,导致目前应用的疫苗免疫效果不够理想。随着分子生物学技术的广泛应用,利用病原菌的抗原蛋白制备的亚单位疫苗是当前疫苗研究热点,亚单位疫苗的理想抗原应该具有：抗原性高,免疫原性强,安全性高等特点。以往理想抗原的筛选较为困难,随着蛋白组学技术：2-DE电泳和质谱分析技术的发展,尤其是结合免疫印迹技术的免疫蛋白组学为筛选新型免疫保护性抗原,应用于研制新型高效亚单位疫苗提供了重要途径。蛋白组学技术的开发... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表（Abbreviation ）
1 文献综述
    1.1 多杀性巴氏杆菌的生物学特性
    1.2 多杀性巴氏杆菌的危害与防治
    1.3 蛋白组学及研究方法
    1.4 免疫蛋白组学与细菌表面蛋白
    1.5 亚单位疫苗
2 研究目的与意义
3 材料与方法
    3.1 菌株和试验动物
    3.2 pET-30a质粒和pMD-18T
    3.3 主要试剂
    3.4 主要缓冲液的配方
    3.5 免疫蛋白的筛选
        3.5.1 菌株的选取与培养
        3.5.2 菌株的定量与保存
        3.5.3 感染血清与对照血清
        3.5.4 ELISA检测血清抗体效价
        3.5.5 细菌表面蛋白的提取
        3.5.6 SDS-PAGE电泳
        3.5.7 蛋白定量
        3.5.8 双向电泳分离
        3.5.9 银染
        3.5.10 Westren b1ot
        3.5.11 蛋白酶解
        3.5.12 MALDI-TOF质谱分析
        3.5.13 PGAM基因gpmA引物设计与合成
    3.6 PGAM蛋白表达及纯化
        3.6.1 PCR扩增及基因测序
        3.6.2 PCR产物回收
        3.6.3 重组表达质粒的构建
        3.6.4 感受态细胞的制备
        3.6.5 连接产物的转化
        3.6.6 质粒的小量制备
        3.6.7 重组质粒的酶切鉴定
        3.6.8 表达菌株的构建
        3.6.9 蛋白诱导表达
        3.6.10 蛋白纯化
    3.7 PGAM蛋白功能研究
        3.7.1 PGAM蛋白对巴氏杆菌生长影响
        3.7.2 HN06对小鼠的半数致死性试验（寇氏（Korbor）法）
        3.7.3 PGAM蛋白免疫Km小鼠及抗体检测与攻毒
4 结果与分析
    4.1 HN06新型免疫蛋白的鉴定
        4.1.1 HN06琼脂糖凝胶相关基因鉴定
        4.1.2 HN06感染血清抗体滴度测定
        4.1.3 SDS-PAGE检测表面蛋白
        4.1.4 2-DE电泳及western blot
        4.1.5 质谱鉴定结果
        4.1.6 蛋白跨膜结构的预测
    4.2 PGAM蛋白的重组表达纯化及活性鉴定
        4.2.1 gpmA基因的克隆及连接鉴定
        4.2.2 测序鉴定
        4.2.3 重组蛋白PGAM表达与纯化
        4.2.4 重组蛋白PGAM免疫活性检测
    4.3 PGAM蛋白的功能研究
        4.3.1 PGAM蛋白对巴氏杆菌生长影响
        4.3.2 HN06小鼠半数致死量LD50测定
        4.3.3 细菌-20℃保存曲线
        4.3.4 PGAM免疫保护力的测定
        4.3.5 PGAM抗体诱导水平探测
5 讨论
    5.1 多杀性巴氏杆菌HN06株新型免疫蛋白鉴定
    5.2 PGAM的功能预测及表达与纯化
    5.3 PGAM对细菌生长影响及免疫功能研究
6 结论
参考文献
附录. 个人简历
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]MALDI-TOFMS技术在肾癌蛋白组学研究进展[J]. 董德鑫,李汉忠.  临床泌尿外科杂志. 2011(06)
[2]多杀性巴氏杆菌病研究进展[J]. 李浩,刘阳,李长安.  畜牧兽医杂志. 2011(02)
[3]差异蛋白组学分析与鉴定方法的研究进展[J]. 达瑞,刘永琦.  吉林医学. 2010(33)
[4]多杀性巴氏杆菌检测、鉴定和分型研究进展[J]. 高明燕,徐步,赵宝华,范建华,龚建森,刘学贤.  动物医学进展. 2010(01)
[5]全菌抗原检测禽霍乱血清抗体ELISA方法的建立[J]. 吕晓娟,龚建森,苗晋锋,施祖灏,单艳菊,张小燕,陆俊贤,葛庆联,刘学贤.  畜牧与兽医. 2008(05)
[6]蛋白质组学的研究进展[J]. 徐丽,刘松财,张永亮.  现代农业科技. 2007(22)
[7]分泌蛋白质组研究进展[J]. 张海婧,刘辉,吕丽艳,陈国强,李智立.  分析化学. 2007(06)
[8]Peroxiredoxin Ⅱ研究进展[J]. 岳海英,黎丹戎,李瑗.  医学研究杂志. 2007(02)
[9]蛋白质芯片及其应用[J]. 严春光,陈钧辉,王新昌.  中国生化药物杂志. 2006(04)
[10]血清蛋白质组学的研究进展[J]. 宋鑫,杨金亮,魏于全.  四川医学. 2005(07)



本文编号：3034273