产甲烷短杆菌M1膜蛋白EhaF异源表达及其对山羊甲烷排放影响的研究

发布时间：2021-02-16 18:22

　　降低反刍动物甲烷的排放,不仅能提高其对饲料的利用率,还可以减轻温室效应,缓解气候变暖,具有重要的生产实践意义和环境保护意义,但目前还缺乏行之有效的技术手段。本试验将产甲烷短杆菌M1中编码膜蛋白EhaF的基因在大肠杆菌中表达,并研究表达产物免疫山羊后对山羊甲烷排放量和瘤胃古菌结构和组成的影响。先从产甲烷短杆菌Methanobrevibacter ruminantium M1全基因序列的适合于克隆和异源表达抗原蛋白的基因中,挑选出候选的抗原基因mru1407。以山羊瘤胃微生物DNA为模板,通过PCR扩增到候选基因,构建重组质粒pET30a（+）-mrul407,并将其转入大肠杆菌Rosseta中进行表达,利用Ni-NTA分离纯化出表达的重组蛋白EhaF,用质谱分析检测纯化蛋白EhaF的氨基酸序列。挑选12只健康山羊作为试验动物,按照体重相近原则将其分为对照组与免疫组,每组设6个重复,每个重复1头羊。所有试验动物统一饲喂精粗比为3：7的全混合日粮,经14天预饲期后开始正式试验。正式试验的第0天对照组注射1ml佐剂与1ml洗脱液组成的混合液,免疫组注射含4001μg重组蛋白EhaF的1ml洗脱... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
引言
第一章 文献综述
    1. 瘤胃甲烷排放及调控措施
        1.1 瘤胃产甲烷菌
        1.2 瘤胃甲烷产生途径
        1.3 瘤胃甲烷减排的调控措施
            1.3.1 调控日粮结构
            1.3.2 添加有机酸
            1.3.3 添加脂质
            1.3.4 使用添加剂
            1.3.5 免疫调控
    2. 产甲烷重组蛋白疫苗
        2.1 反向疫苗学
        2.2 产甲烷菌广谱抗原基因的筛选
        2.3 EhaF
    3. 高通量测序在瘤胃产甲烷菌研究上的应用
        3.1 Roche GS FLX+system
        3.2 Ion Torrent PGM
        3.3 Miseq测序的Illumina
    4 存在的问题及本研究的目的意义
        4.1 存在的问题
        4.2 本研究的目的及意义
第二章：试验研究
    试验一：重组蛋白的异源表达及纯化、鉴定
        1. 材料
            1.1 试验材料
                1.1.1 目的基因：mru1407
                1.1.2 菌株及载体
            1.2 主要仪器和设备
            1.3 生物信息软件
            1.4 试剂
        2. 试验方法
            2.1 目的基因克隆及重组质粒的构建
                2.1.1 引物设计
                2.1.2 PCR扩增目的基因
                2.1.3 PCR产物回收
                2.1.4 PCR产物及pET30a（+）双酶切
                2.1.5 酶切产物胶回收及产物连接
                2.1.6 大肠杆菌Top10感受态的制备
                2.1.7 连接产物转化
                2.1.8 阳性克隆鉴定
            2.2 表达菌株的构建
                2.2.1 大肠杆菌Rosetta感受态的制备
                2.2.2 阳性克隆子及空载的转化及鉴定
            2.3 重组质粒在ROSETTA的表达
                2.3.1 小规模重组质粒表达
                2.3.2 重组蛋白EhaF的纯化
                2.3.3 重组蛋白SDS-PAGE条带的质谱分析
                2.3.4 大规模重组质粒表达
        3. 结果
            3.1 重组质粒的构建
            3.2 重组质粒PET30A（+）·MRU1407的表达
            3.3 重组蛋白的纯化及鉴定
        4. 讨论
            4.1 表达载体的构建及蛋白的表达
            4.2 蛋白的纯化及鉴定
        5. 小结
    试验二：重组蛋白EhaF免疫山羊及免疫效果评价
        1. 材料
            1.1 试验材料
                1.1.1 重组蛋白EhaF
                1.1.2 试验动物
            1.2 试验日粮
            1.3 主要仪器和设备
            1.4 试剂
            1.5 生物信息学分析软件及数据库
        2. 方法
            2.1 重组蛋白EhaF免疫山羊
                2.1.1 试验准备
                2.1.2 免疫程序及采样时间
                2.1.3 样品采集方法
            2.2 抗体滴度检测
            2.3 甲烷排放量检测
            2.4 提取瘤胃微生物总DNA
            2.5 Miseq测序
            2.6 数据分析
        3. 结果
            3.1 血液指标
            3.2 清、唾液及瘤胃液抗体滴度
            3.3 甲烷排放量
            3.4 Miseq测序
                3.4.1 稀释曲线
                3.4.2 物种注释
                3.4.3 Alpha多样性
                3.4.4 产甲烷菌属丰度的比对
        4. 讨论
            4.1 血液生化指标及血常规
            4.2 血清、唾液瘤胃液抗体滴度
            4.3 甲烷排放量
            4.4 稀释曲线
            4.5 物种注释
            4.6 Alpha多样性
            4.7 产甲烷菌丰度的对比
        5. 小结
第三章：结论及创新点
    1. 结论
    2. 创新点
    3. 需进一步研究的问题
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]A组链球菌M蛋白重组多肽原核表达载体构建及融合蛋白的表达[J]. 丁月霞,倪琼琼,刘金来.  中国免疫学杂志. 2013(01)
[2]高通量测序技术及其应用[J]. 王兴春,杨致荣,王敏,李玮,李生才.  中国生物工程杂志. 2012(01)
[3]MiSeq:新一代个人化测序仪[J]. 周林文.  生物技术世界. 2011(05)
[4]反刍动物瘤胃甲烷产生及调控的研究进展[J]. 李琳,董国忠.  草食家畜. 2010(02)
[5]大肠杆菌表达系统的研究进展[J]. 解庭波.  长江大学学报(自科版)医学卷. 2008(03)
[6]焦磷酸测序技术及应用[J]. 汤华阳,杜卫东,张学军.  医学分子生物学杂志. 2007(03)
[7]肉牛甲烷排放影响因素的试验研究[J]. 樊霞,董红敏,韩鲁佳,黄光群.  农业工程学报. 2006(08)
[8]SDS-PAGE 法测定His-tag 融合蛋白分子量产生偏差的原因[J]. 唐威华,张景六,王宗阳,洪孟民.  植物生理学报. 2000(01)

硕士论文
[1]猪硒蛋白IDⅡ和Sel S基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备[D]. 唐莲.四川农业大学 2012
[2]日粮添加不同水平尿素对山羊生产性能及血液生化指标的影响[D]. 蒋加进.南京农业大学 2006



本文编号：3036750