布拉氏酵母菌基因敲除系统的构建及初步应用

发布时间：2021-02-19 14:55

　　布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）是1920年从印尼水果中分离得到的一种非致病性酵母菌，作为益生菌被欧洲、非洲和南非等国家广泛的应用于治疗和预防腹泻和肠道失调。布拉氏酵母菌被认为是最有价值的益生菌之一。传统意义上，益生菌作为食物添加剂来改善肠道微生物平衡，还可以用来治疗感染性胃肠炎和治疗过程中抗生素引起的并发症性腹泻。对布拉氏酵母菌益生性的研究成为热点。然而，多数研究着眼于生产和临床应用，关于布拉氏酵母菌益生机制特别是分子方面的研究却很少。其主要的原因是，没有适合布拉氏酵母菌的分子遗传工具。包括关键基因的敲除、调控表达、表面展示等。研究表明，布拉菌是酿酒酵母（S. cerevisiae）的变异株。尽管很多研究证明布拉氏酵母菌是酿酒酵母的一个分支，但是却有一些完全不同于酿酒酵母的生物学、生理学、代谢及遗传学特性，例如，布拉氏酵母菌不能利用半乳糖，对低pH和温度有很高的耐受性，并且在氮源缺乏时可以形成假菌丝，特别是布拉氏酵母菌是双倍体而且不能孢子化。许多适用于酿酒酵母的分子遗传工具不能直接用于布拉氏酵母菌。想要研究布拉氏酵母菌益生机制，需要构建适合的分子遗传工具... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
符号及缩略词
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 S. boulardii 生物学分类
    1.2 S. boulardii 的培养特性
    1.3 S. boulardii 的作用机制及临床应用
        1.3.1 S. boulardii 的营养肠道的作用
        1.3.2 S. boulardii 对肠出血性大肠杆菌（EHEC）的拮抗作用
        1.3.3 S. boulardii 对肠致病性大肠杆菌（EPEC）的拮抗作用
        1.3.4 S. boulardii 对梭菌的拮抗作用
        1.3.5 S. boulardii 对霍乱弧菌的拮抗作用
        1.3.6 S. boulardii 的抗病毒作用
        1.3.7 S. boulardii 的抗癌作用
        1.3.8 S. boulardii 对啮齿类枸橼酸杆菌的拮抗作用
    1.4 S. boulardii 在畜牧业的应用
    1.5 基因敲除技术研究进展
        1.5.1 基因敲除技术概述
        1.5.2 噬菌体重组酶敲除系统
        1.5.3 基因敲除技术在酿酒酵母中的应用
    1.6 本研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 质粒和菌株
        2.1.2 主要仪器和设备
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 有关培养基和溶液的配制
    2.2 试验方法
        2.2.1 引物设计与合成
        2.2.2 质粒的构建
        2.2.3 酵母菌的计数
        2.2.4 抗生素的筛选
        2.2.5 酵母基因组 DNA 的提取
        2.2.6 基因敲除盒的构建
        2.2.7 布拉氏酵母菌的转染
        2.2.8 URA3 基因的敲除
        2.2.9 MCD4 基因的敲除
        2.2.10 PCR 方法鉴定阳性转染子
        2.2.11 敲除基因重新导入实验
        2.2.12 外源基因的删除
        2.2.13 生长曲线的测定
        2.2.14 葡聚糖的测定
        2.2.15 细胞壁敏感性的测定
3 试验结果
    3.1 布拉氏酵母基因敲除系统的构建
        3.1.1 抗生素的筛选
        3.1.2 pYES2-KanMX 的构建
        3.1.3 诱导质粒的构建
        3.1.4 pSbGDDH 的构建
        3.1.5 pSbMUDH 的构建
        3.1.6 pSbMR 的构建
    3.2 URA3 基因缺失突变株的构建
        3.2.1 URA3 短同源臂敲除盒的构建
        3.2.2 URA3 长同源臂基因敲除盒的构建
        3.2.3 URA3 等位基因的敲除
        3.2.4 删除外源基因
        3.2.5 URA3 基因重新导入试验
    3.3 MCD4 基因缺失突变株的构建及表型研究
        3.3.1 MCD4 短同源臂敲除盒
        3.3.2 MCD4 长同源臂基因敲除盒构建
        3.3.3 MCD4 等位基因的敲除
        3.3.4 MCD4 基因重新导入结果
        3.3.5 MCD4 基因突变株表型的研究
4 讨论
5 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]布拉氏酵母菌特性及培养条件的研究[J]. 肖永友,方志逸,陈倩婷,尹翠金,朱丽如.  饲料研究. 2010(03)



本文编号：3041276