永生化猪小肠上皮细胞系的建立及猪轮状病毒对其影响的研究

发布时间：2021-02-21 17:03

　　在体外培养条件下，正常组织来源的细胞通常经过有限次的传代后，就会停止分裂增殖，发生衰老和死亡。原代猪小肠上皮细胞（pSIECs）与其他正常组织来源的细胞一样，在体外经过8～13次的传代后，就停止分裂增殖。猪轮状病毒（Porcine rotavirus, PRV）是引起仔猪腹泻的主要病原之一，在体外，轮状病毒虽可吸附于多种细胞，但只感染来源于肠道上皮的细胞和肾细胞。轮状病毒的吸附和感染过程需要胰蛋白酶的参与来增加病毒对宿主细胞的感染性，通常在无血清的条件下培养宿主细胞。然而，原代小肠上皮细胞对无血清培养极其敏感。另外，原代小肠上皮细胞的扩大培养也相当困难。尽管使用异源性细胞培养模型也可以获得很多有价值的信息，但是这些细胞可能不能应用于猪，因为不同的轮状病毒株具有种属差异性，细胞受体及因子的差别都会影响轮状病毒的吸附、感染、复制及致病性。这些难题阻碍了对猪轮状病毒（PRV）致病机理研究的进程。因此，研究轮状病毒的致病机理，同源性宿主细胞的获得极其必要。本研究的目的是通过转染外源基因的办法延长体外培养的猪小肠上皮细胞的寿命，建立具有正常上皮细胞形态和功能的永生化猪小肠上皮细胞系，然后研究猪轮... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：145 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
文献综述
    第一章 肠上皮细胞与细胞永生化
        1.1 肠上皮细胞与免疫
            1.1.1 小肠上皮与疾病发生
            1.1.2 上皮细胞影响肠道免疫细胞
            1.1.3 肠上皮细胞引发肠道内的免疫耐受
            1.1.4 免疫细胞影响肠道上皮细胞
            1.1.5 肠上皮细胞的调控与炎症发生
        1.2 端粒酶活化与细胞永生化
            1.2.1 细胞衰老和端粒损伤
            1.2.2 端粒酶与衰老
            1.2.3 端粒酶活性与抗衰老
    第二章 轮状病毒研究进展
        2.1 轮状病毒的基因组结构及生物学特性
            2.1.1 轮状病毒的基因组结构
            2.1.2 轮状病毒的分类
            2.1.3 轮状病毒的复制周期
        2.2 轮状病毒的致病机制
        2.3 NSP4 蛋白在轮状病毒复制和致病中的作用
            2.3.1 NSP4 的结构和膜拓扑学
            2.3.2 NSP4 受体活性
            2.3.3 NSP4 与胞内钙离子（Ca2+）内稳态
            2.3.4 NSP4 与细胞蛋白的相互作用
            2.3.5 NSP4 作为肠毒素的释放
        2.4 Viroporin 的结构及生物学特性
            2.4.1 Viroporin 的结构分类
            2.4.2 Viroporin 的细胞病变效应
            2.4.3 膜重塑及糖蛋白的运输
            2.4.4 Viroporin 与病毒生命周期
            2.4.5 Viroporin 的孔形成活性
试验研究
    第三章 永生化猪小肠上皮细胞系的建立
        3.1 材料
            3.1.1 细胞、菌株与质粒
            3.1.2 主要试剂
            3.1.3 主要仪器与设备
        3.2 方法
            3.2.1 细胞培养液配方
            3.2.2 pCI-neo-hTERT 质粒的转化与鉴定
            3.2.3 pCI-neo-hTERT 质粒转染猪小肠上皮细胞
            3.2.4 转染细胞鉴定
            3.2.5 转染细胞生长特性的检测
            3.2.6 RT-PCR 检测转染细胞中外源性 hTERT 基因的表达
            3.2.7 细胞的转化特征鉴定
            3.2.8 HE 染色
            3.2.9 转染细胞端粒酶活性检测
        3.3 结果
            3.3.1 pCI-neo-hTERT 测序鉴定
            3.3.2 猪小肠上皮细胞最佳 G418 筛选浓度确定
            3.3.3 转染后阳性克隆的获得
            3.3.4 形态学鉴定
            3.3.5 SIEC02 细胞的肠上皮特征鉴定
            3.3.6 生长曲线和细胞周期与凋亡
            3.3.7 转染后细胞的 hTERT 基因的 RT-PCR 检测
            3.3.8 端粒酶活性检测
            3.3.9 SIEC02 细胞转化能力分析
            3.3.10 接触抑制性
            3.3.11 细胞增殖分析
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 永生化猪小肠上皮细胞的生物学特性研究
        4.1 材料
            4.1.1 主要试剂和细菌
            4.1.2 主要仪器设备
        4.2 方法
            4.2.1 细菌侵染
            4.2.2 细菌黏附
            4.2.3 免疫刺激
            4.2.4 实时荧光定量 PCR 检测免疫相关基因
        4.3 结果
            4.3.1 细菌对永生化猪小肠上皮细胞的黏附试验
            4.3.2 细菌侵染效率检测
            4.3.3 SIEC02 细胞对沙门菌感染与 LPS 刺激产生免疫应答的检测
            4.3.4 血清对 SIEC02 细胞的影响
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章 猪轮状病毒对永生化猪小肠上皮细胞的影响
        5.1 材料
            5.1.1 细胞及其培养条件
            5.1.2 病毒
            5.1.3 主要试剂
            5.1.4 主要仪器
        5.2 方法
            5.2.1 细胞培养
            5.2.2 病毒复壮与增殖
            5.2.3 猪轮状病毒感染 SIEC02 细胞
            5.2.4 细胞活力检测
            5.2.5 猪轮状病毒致细胞病变作用的检测
            5.2.6 直接免疫荧光检测病毒蛋白的表达
            5.2.7 Hochest 33258 染色检测
            5.2.8 ELISA 检测细胞凋亡
            5.2.9 TUNEL 检测早期细胞凋亡
            5.2.10 透射电镜检测
            5.2.11 流式细胞仪检测凋亡
            5.2.12 线粒体膜电位检测
        5.3 结果
            5.3.1 猪轮状病毒对 SIEC02 活力影响
            5.3.2 猪轮状病毒诱导 SIEC02 细胞发生细胞病变
            5.3.3 流式细胞仪检测病毒蛋白的表达
            5.3.4 透射电镜结果
            5.3.5 猪轮状病毒诱导的凋亡
        5.4 讨论
        5.5 小结
    第六章 猪轮状病毒 NSP4 蛋白的亚细定位及对猪小肠上皮细胞凋亡的影响
        6.1 材料
            6.1.1 材料
            6.1.2 试剂和抗体
            6.1.3 主要仪器
        6.2 方法
            6.2.1 细胞的培养
            6.2.2 病毒增殖和感染
            6.2.3 引物设计
            6.2.4 基于 NSP4 基因相关 DNA 片段的载体构建
            6.2.5 重组质粒转染 SIEC02 细胞
            6.2.6 内质网定位载体 pDsred-ER 单克隆细胞的构建
            6.2.7 亚细胞定位
            6.2.8 Western blot 分析
            6.2.9 Real-time PCR
        6.3 结果
            6.3.1 PCR 扩增及重组质粒鉴定结果
            6.3.2 猪轮状病毒 NSP4 viroporin 蛋白及其两翼结构亚细胞共定位
            6.3.3 NSP4 蛋白及其 viroporin 对 caspase-3、Bax 和 Bcl-2 蛋白表达水平影响
            6.3.4 NSP4 蛋白及其 viroporin 对 caspase-8 和 caspase-9 蛋白水平影响
            6.3.5 NSP4 蛋白及其 viroporin 对 Bax 和 Bcl-2 转录表达水平影响
        6.4 讨论
        6.5 小结
结论
参考文献
附录
缩略词
致谢
个人简介



本文编号：3044654